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Die Etablierung massenspektrometrischer quantitativer Studien des Herzproteoms während der embryonalen Entwicklung und der Alterung

Konzer, Anne - Justus-Liebig-Universität Gießen (2012)


Neue Erkenntnisse über die physiologischen, molekularen und pathologischen Prozesse im Herzen konnten im letzten Jahrzehnt anhand von Modellorganismen gewonnen werden. Die Entwicklung neuer Techniken ermöglichte außerdem die Etablierung umfangreicher und eindrucksvoller Studien basierend auf den neusten Mikroskopieverfahren, auf globalen Genexpressionsanalysen (Microarray) sowie auf modernen Massenspektrometrie (MS)- basierenden Proteinanalysen anhand von hochauflösenden Tandem-Massenspektrometern.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Fokus auf die quantitative Proteinanalyse des Herzens gelegt. Mit Hilfe der Massenspektrometrie und der SILAC-basierenden Proteinquantifizierung sollten herzspezifische Veränderungen während der embryonalen Entwicklung sowie während der Alterung analysiert werden. Um eine robuste und hochwertige Proteinquantifizierung im Zebrafisch Danio rerio zu ermöglichen, wurde der Modellorganismus nach der SILAC-Methode mit der Isotopen-gekoppelten Aminosäure Lysin-6 markiert. Für die vollständige Markierung des Zebrafisches wurde ein SILAC-Futter speziell für larvale und adulte Fische entwickelt, das Lysin-6-markierten Zellen von S. cerevisiae, E. coli, SILAC-Mausfutter sowie Gewebe der SILAC-Maus bzw. Lysin-6-markierte Larven von D. melanogaster enthält. Die partielle (pulse) SILAC-Markierung der Fische konnte für globale Proteinstudien genutzt werden, um Markierungsraten in verschiedenen Organen und Regenerationsprozesse in der Schwanzflosse zu dokumentieren. Neben der allgemeinen Charakterisierung regenerativer Prozesse konnten Faktoren der Flossenregeneration wie Actinodin 2 und 4 identifiziert werden.

Die vollständige Markierung der Zebrafische wurde in der ersten Filialgeneration (F1) mit einer Lysin-6-Inkorporation von 95% in adulten Fischen erreicht. Anschließen konnte die hohe Präzision der Proteinquantifizierung basierend auf dem SILAC-Zebrafisch als internen Standard anhand von technischen und biologischen Triplikaten bestätigt werden. Um die späte embryonale Herzentwicklung im Zebrafisch zu studieren, wurden embryonale Herzen zu den Zeitpunkten 72 und 120 hpf isoliert und mit SILAC-Embryonen als internen Proteinstandard gemischt. Anhand von 1398 Proteinen, die massenspektrometrische (LC-MS/MS) identifiziert wurden, konnte eine Anreicherung von Proteinen der DNA-Replikation und Translation zum frühen Zeitpunkt sowie eine Anreicherung von strukturellen Proteinen der Sarkomere und Calcium-bindenden Proteinen zum späten Zeitpunkt detektiert. Diese Ergebnisse beschreiben den Übergang von proliferierenden zu ausdifferenzierten Kardiomyozyten während der späten embryonalen Entwicklung. Um die Konsequenz eines entwicklungsbiologisch wichtigen Faktors bei der Herzentwicklung zu untersuchen, wurde die Expression des Proteins activated leukocyte cell adhesion molecule (ALCAM) durch eine Morpholino-Injektion im Zebrafisch inhibiert und der resultierende Phänotyp analysiert. Auf Protein- und Transkriptebene konnte eine reduzierte Expression augenspezifischer Proteine detektiert werden, die auf eine verzögerte Differenzierung neuronaler Zellen in der Retina hinweisen. Um den herzspezifischen Phänotyp zu charakterisieren, erfolgte die Analyse isolierter embryonaler Herzen aus ALCAM-Morphanten. Die reduzierte Expression von Proteinen der Zelladhäsion und der Organisation des Cytoskeletts wie Paralemmin (PALM), dem Integrinrezeptor (itgb1b) und der GTPase Ras-like protein Rac1a konnten detektiert werden. Wahrscheinlich führt ein Funktionsverlust von ALCAM zu einer verminderten Kontrolle der Zellform sowie zu einer beeinträchtigen Koordination der Zell-Zellkontakte, da die komplexe Interaktion zwischen Transmembranproteinen, Adapterproteinen und dem Cytoskelett beeinflusst wird.

Neben den entwicklungsbiologischen Fragestellungen standen in der vorliegenden Arbeit auch die Analysen von altersbedingten Veränderungen der Herzfunktion im Vordergrund. Hierfür wurden Kardiomyozyten aus jungen (2 Monate) und gealterten (22 und 30 Monate) Mäusen isoliert und für eine quantitative Proteomanalyse basierend auf der SILAC-Maus eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass Maus-Kardiomyozyten während der Alterung minimale Adaptionen im Fettsäurestoffwechsel sowie eine beeinträchtigte zelluläre Antwort auf oxidativen Stress aufweisen. Zusätzlich wurde erstmals eine altersbedingt erhöhte Expression von Proteinen identifiziert (u.a. BDH1), die am Ketonstoffwechsel beteiligt sind. BDH1 katalysiert die Synthese des Ketonkörpers Acetacetat, für den bereits eine Funktion als Antioxidanz beschreiben wurden. Daher könnte es sich hier um eine altersbedingte Schutzfunktion vor oxidativem Stress im Herzen handeln.


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