Unsere Seite auf

Dissertationen
Linksammlung durchsuchen

 

Molekularbiologische und biochemische Charakterisierung eines Adeninnukleotid-Translokator (ANT)-transgenen Tiermodells

Klumpe, Inga - Freie Universität Berlin (2012)


Der Adeninnukleotid-Translokator (ANT) ist eine zentrale Komponente des mitochondrialen Energiestoffwechsels. Er ermöglicht den Austausch von zytosolischem ADP und mitochondrialem ATP über die innere mitochondriale Membran. Darüber hinaus ist der ANT ein essentieller Regulator der Apoptose. Herzerkrankungen wie Ischämie und Hypoxie sind mit einem gestörten Energiestoffwechsel und einer ANT-Dysfunktion verbunden. Dies führt zur Reduktion des intrazellulären ATP-Gehalts, zur Entstehung von oxidativem Stress und zum Zusammenbruch der zellulären Homöostase, was Nekrose und Apoptose auslöst. Im ersten Teil der Arbeit wurde daher analysiert, ob eine ANT1-Überexpression bei Hypoxie und Ischämie protektiv wirkt.

Im Hypoxie-Modell wurden WT- und ANT1-neonatale Rattenkardiomyozyten (NRCM) für 24 h (akut) und 48 h (chronisch) hypoxischen Bedingungen ausgesetzt und in Bezug auf die zuvor genannten Veränderungen analysiert. Hypoxische WT-NRCM zeigten im Verlauf der Hypoxie einen stetig abnehmenden ATP-Gehalt, der in den ANT1-NRCM hingegen zunächst unbeeinflusst blieb und sich erst bei chronischer Hypoxie reduzierte. Darüber hinaus war die Produktion von Sauerstoffradikalen in den ANT1-NRCM signifikant geringer und parallel dazu wurde das antioxidative Stress-System nicht aktiviert. Ein stabilerer Energiemetabolismus und verminderter oxidativer Stress trugen zur Hemmung der Apoptose- und Nekrose in den ANT1-NRCM bei akuter und chronischer Hypoxie bei. Zudem mussten weitere Schutzmechanismen existieren, die die ANT1-NRCM effektiver vor Apoptose und Nekrose-Induktion schützten. Diese Studie zeigte, dass die zellprotektiv wirkenden Akt- und ERK1/2-Signalwege in den ANT1-NRCM verstärkt aktiviert waren. Auch wurde das Hitzeschockprotein 90, ein Chaperon und Stabilisator der aktiven Akt, verstärkt gebildet. Die Akt- und ERK1/2-Kinasen fördern das Überleben der Zelle durch Aktivierung anti-apoptotischer Zielproteine und Hemmung pro-apoptotischer Faktoren, wie die Initiator-Caspase-9, was die verminderte Aktivierung von Caspase-3/7 und die geringere DNA-Fragmentierung in ANT1-NRCM erklärt. Darüber hinaus aktivieren Akt und ERK1/2 den Transkriptionsfaktor HIF-1α, der das Überleben der Zellen sichert und in ANT1-NRCM vermehrt gebildet wurde. Insgesamt führen ein stabilerer Energiemetabolismus, geringerer oxidativer Stress sowie die massive Aktivierung von protektiven Akt- und ERK1/2-Signalwegen bei Hypoxie in ANT1-überexprimierenden NRCM zu einer erhöhten Resistenz gegen Apoptose- und Nekrose.

Auch in vivo war ein deutlich positiver Effekt der ANT1-Überexpression zu beobachten. ANT1-Ratten zeigten bei myokardialer Ischämie eine höhere Überlebensrate, im Vergleich zum WT, nach Ligatur der linken proximalen Koronararterie. Die ANT1-Ratten besaßen zudem ein geringeres Infarktareal und einen unauffälligen Peroxidanteil im Blutserum sowie weniger Proteincarbonylierungen als Zeichen von vermindertem oxidativen Stress. Frühere Studien belegen, dass eine ANT1-Überexpression im Myokard unter pathophysiologischen Bedingungen die Myozytenstruktur und -funktion stabilisiert. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die transgene ANT1-Überexpression schon unter basalen Bedingungen das kontraktile System und den Ca2+-Haushalt sowie die Morphologie der Kardiomyozyten beeinflusst. ANT1-Ratten exprimierten im Vergleich zum WT verstärkt kontraktile Proteine wie Myosin, Aktin und Troponin I sowie die Ca2+-ATPasen PMCA und SERCA2a im Myokard, die für den Ca2+-Rücktransport bei der Relaxation verantwortlich sind. Parallel dazu nahm die SERCA2a-Aktivität signifikant zu. Diese Protein- und Aktivitätsänderungen resultierten in einer zellulären physiologischen Hypertrophie und einer beschleunigten Kontraktilität von ANT1-adulten Rattenkardiomyozyten. Somit nimmt der ANT1 nicht nur Einfluss auf die mitochondriale Funktion und die Apoptose, sondern stabilisiert das kontraktile System, so dass dieses protektiv kontraktile Dysfunktionen kompensieren kann.

Die kardiale ANT1-Überexpression beeinflusst basal und unter pathophysiologischen Bedingungen viele intrazelluläre Prozesse. Daher war es von besonderem Interesse, Substanzen zu identifizieren, die die ANT1-Genexpression regulieren. Für diese Untersuchungen wurde ein Reporterplasmid generiert, bei dem eine Luziferase unter der Kontrolle von Promotorelementen des murinen ANT1-Gens stand. Nach Transfektion in kardiale HL-1-Zellen erfolgte die Stimulation mit IL-1β, TGF-β1, TNFα und IL-4, die das Entzündungsgeschehen, die Zelldifferenzierung, Apoptose und den Energiestoffwechsel beeinflussen. Parallel dazu wurde die Wirkung der Stimulanzen auf die endogene ANT1-Genexpression in NRCM untersucht. Auf Transkriptionsebene regulierte nur IL-1β die ANT1-Expression herunter und bewirkt somit eine verminderte Stresstoleranz der Zellen.

Zusammenfassend wirkt die ANT1-Überexpression unmittelbar auf die zelluläre Stressresistenz. Über den gezeigten Einfluss auf den Apoptoseprozess, die Signaltransduktion und die Kontraktilität erweist sich der ANT1 als zentrale Regulationsstelle im intrazellulären Geschehen.


—> Volltext

Abonnieren:

Empfehlen: