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Zeitaufgelöste fluoreszenzspektroskopische Untersuchungen an der cytoplasmatischen Oberfläche von Rhodopsin

Kim, Tai-Yang - Freie Universität Berlin (2012)


In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen an der cytoplasmatischen Oberfläche des lichtsensitiven Sehpigments Rhodopsin durchgeführt. Diese Rezeptoroberfläche spielt eine entscheidende Rolle bei der Rezeptoraktivität, da sich dort nach Aktivierung der Lichtantenne - dem Liganden Retinal - die Rezeptorkonformationen manifestieren, die zur Bindung des G-Proteins Transducin und des Inhibitorproteins Arrestin führen.

Ziel der Arbeit war es, die Dynamik und die Änderungen der Umgebungsparameter an der cytoplasmatischen Oberfläche in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern zu bestimmen. Dazu wurden Fluoreszenzanisotropieexperimente mit einem an der amphiphatischen Helix 8 an Position Cys316 gebundenen Fluorescein durchgeführt. Über eine Analyse der Fluoreszenzanisotropiekurven mit Hilfe der Ordnungsparameter und konnte ein direkter Zusammenhang zwischen dem Bewegungsmodell von Helix 8, dem Rezeptorzustand, welcher unter anderem von pH und Temperatur abhängig ist, und der Proteinumgebung ermittelt werden.

Im Zuge der Arbeit wurde eine zeitkorrelierte Einzelphotonenzählungs (TCSPC)-Apparatur zur Detektion zeitaufgelöster Fluoreszenz- und Dynamikänderungen zu einer multidimensionalen TCSPC-Apparatur für Fluoreszenz Pump-Probe Messungen ausgebaut. Damit können nun zeitaufgelöste Fluoreszenz- und Dynamikänderungen in Abhängigkeit der Proteinfunktion detektiert werden. Die Proteinreaktion wird durch einen Farbstofflaser angeregt. Auf der Zeitachse der Proteinreaktion werden dann sequenziell Pikosekunden-zeitaufgelöste Fluoreszenzzerfallskurven aufgenommen, die es erlauben, die Veränderung der Nanosekunden-Oberflächendynamik zu verfolgen. Zum automatisierten Austausch der Probe wurde eine Flußzelle in den Aufbau integriert. Mit dieser Apparatur wurde die Kinetik der Bindung des G-Proteins Transducin an den Sehrezeptor Rhodopsin mit Hilfe eines in der Arbeitsgruppe neuentwickelten, fluoreszenzbasierten Helix-Faltungs-Sensors untersucht, welches dem C-terminalen Ende der katalytischen Alpha-Untereinheit des Transducins entspricht. Dieses C-terminale Ende der Alpha-Untereinheit gehört zu den drei Bindungsankern des Transducins und bindet spezifisch an den aktivierten Rezeptor. Es konnte damit gezeigt werden, daß die Kinetik der Bindung des Peptides an das lichtaktivierte Rhodopsin zweistufig ist. Der erste Schritt - die Vorbindung - findet in Membranumgebung vor der Ausbildung des aktiven Meta-II Intermediats von Rhodopsin statt. Der zweite Schritt - die Helixbildung des Sensors durch die Änderung der Konformation an der cytoplasmatischen Oberfläche - findet nach der Ausbildung von Meta-II statt.

Ebenfalls wurde ein Mikroskopaufbau zur Messung der internen Totalreflektionsfluoreszenz (TIRF) in der Arbeitsgruppe etabliert, mit dessen Hilfe die Diffusion von einzelnen lichtaktivierten Rhodopsinmolekülen in nativen Diskmembranfragmenten untersucht wurde. Es konnte damit ein heterogenes Diffusionsverhalten der lichtaktivierten Rhodopsinmoleküle in nativen Membranen nachgewiesen werden. Ein Teil der Moleküle ist wahrscheinlich in Oligomeren organisiert und diffundiert langsam über die Diskmembran. Der andere Teil der Moleküle bewegt sich in kleineren Einheiten mit einer höheren Diffusionsrate über die Diskmembran. Zusätzlich ist eine Einschränkung der Diffusion auf Bereiche zu erkennen, welche der Größe der gemessenen Diskmembranfragmente entsprechen.


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