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Systeme für die Chip-basierte Nukleinsäure-Analytik mit integrierter DNA-Amplifikation und Detektion

Julich, Sandra - Friedrich-Schiller-Universität Jena (2011)


Die vorgelegte Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von Lab-on-a-Chip Systemen für die Bioanalyik. Die Zielstellung bestand in der Übertragung molekularbiologischer Nachweismethoden zur spezifischen Amplifikation und Untersuchung von Nukleinsäuresequenzen in den miniaturisierten Maßstab. Dabei wurde ein System zur on-Chip Real-Time PCR (Polymerase Kettenreaktion, engl. Polymerase Chain Reaction) umgesetzt, wobei die Reaktionslösung als Tropfen mit einem Volumen von wenigen Mikrolitern auf der Oberfläche eines Probenträgers appliziert wurde. Die Oberfläche dieses Probenträgers wurde zu diesem Zweck mit Repel-Silan sowie Teflon beschichtet und strukturiert, wodurch die in Mineralöl eingebettete Reaktionslösung einen halbkugelförmigen Tropfen ausbildet und somit vor Verdunstung geschützt wird.

Ein zweites System zur Verknüpfung der DNA-Amplifikation mit einem Mikroarray- basierten Nachweis wurde entwickelt. An diesem System wurde speziell der Nachweis verschiedener Arten des Pflanzenpathogens Phytophthora etabliert. Die Funktionsfähigkeit der beiden Systeme konnte anhand unterschiedlicher Anwendungsbeispiele demonstriert werden. Mit Hilfe der on-Chip Real-Time PCR konnten Genabschnitte detektiert werden, darunter der Tumorsupressor p53. Neben DNA und RNA wurden auch Zellen bzw. Sporen direkt als Ausgangsmaterial bei der Chip-PCR eingesetzt, wodurch auf eine aufwändige Extraktion der Nukleinsäuren verzichtet werden konnte. Hinsichtlich der Sensitivität konnte gezeigt werden, dass einzelne DNA-Moleküle sowie einzelne Zellen bzw. wenige Sporen nachweisbar sind. Die hohe Spezifität der Nachweismethoden konnte ebenfalls demonstriert werden, vor allen bei der Verwendung Sequenz-spezifischer Oligonukleotide, beispielsweise als Fluoreszenz-markierte Sonden bei der Real-Time PCR oder in Form von Fänger-Molekülen auf dem DNA-Mikroarray. Mittels Sequenz-spezifischer Hybridisierung konnten fünf nah verwandte Phytophthora-Arten eindeutig voneinander unterschieden werden.


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