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28.03.2024
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Synthese und Analyse von Liganden des CCR5-Rezeptors

Jürs, Beatrice - Universität Hamburg (2011)


Die Infektion des Humanen Immundefizienzvirus (HIV) wird durch die Interaktion des viralen Oberflächenproteins gp120 mit dem humanen Rezeptor CD4 eingeleitet. Anschließend findet eine zweite Wechselwirkung mit dem CCR5-Corezeptor statt, durch die eine Membranfusion vermittelt und die virale Erbinformation in die humane Zelle geschleust wird. Die Deletion von 32 Basenpaaren des CCR5-Gens (CCR532) bei Menschen, die homozygot bezüglich dieser Deletion sind, führt zu keinen immunologischen Nachteilen und verhindert, dass diese Menschen HIV-infiziert sind. Daher bietet die Inhibition des CCR5-Rezeptors einen versprechenden Ansatz zum Unterbinden des HIV-entry.

Neben der viralen V3-loop, der eine starke Interaktion zum CCR5 während des entryzugeteilt wird, liegen in dem in-silico Homologiemodell von W. Scherres weitere Sequenzen in unmittelbarer Nähe zum Corezeptor. Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei Sequenzen identifiziert, die in-silico Wechselwirkungen mit CCR5 eingehen. Dabei handelt es sich um die Sequenz 204ACPKVS209 (Peptid 1) der C1-Region und um 436APPIEGQI443 (Peptid 2) der C4-Region des viralen gp120. Diese Sequenzen und verschiedene Derivate beider Regionen wurden als Peptidbibliothek synthetisiert. In einer ersten Bindungsstudie wurde mit Hilfe der Oberflächenplasmonenresonanz eine qualitative Aussage über die Bindungsaffinitäten der Peptide getroffen. Die Sequenz der C1-Region zeigte keinerlei Bindung zum CCR5. Der Sequenz der C4-Region konnte eine starke Bindungsaffinität zum CCR5 zugeschrieben werden. Um diese genauer innerhalb der Sequenz lokalisieren zu können, wurden ebenfalls Derivate des Peptids 436APPIEGQI443 mittels SPR untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die Aminosäuren 440EGQI443 einen höheren Anteil der Bindung als die Region 436APPI439 aufweisen. Doch auch bei der am N- und C-Terminus um zwei Aminosäuren verlängerte Sequenz 434MYAPPIEGQIEG445 konnten starke Wechselwirkungen zum CCR5 analysiert werden.

Da es sich bei dem CCR5-Corezeptor um einen 7-Helixtransmembranrezeptor handelt, wurden während dieser Dissertation für alle Bindungsstudien CCR5-überexprimierende Zellenverwendet. Um eine quantitative Aussage der Bindungsstudien treffen zu können, musste vorab die Rezeptoranzahl pro Zelle ermittelt werden. Diese wurde mit Hilfe der Durchflusszytometrie auf 40000 Rezeptoren pro Zelle bestimmt. Mit Hilfe dieser Methode wurde ebenfalls eine Bindungsstudie durchgeführt. Dazu wurde die Leitstruktur 2 436APPIEGQI443 mit dem Fluorophor Cy3 markiert. Strukturbedingt konnte pro Peptid nur ein Molekül Cy3 unter Amidkupplung gebunden werden. Durch diese Bedingung war es möglich, pro detektiertem Ereignis der Messung von einer 1:1-Bindung zwischen fluorophormarkiertem Peptid 2+Cy3 und CCR5-Rezeptor auszugehen. Die Messung der Durchflusszytometrie ergab eine thermodynamische Dissoziationskonstante KD von 25 ± 4 mM für das Peptid 2+Cy3.

Mit Hilfe der STDD-NMR-Spektroskopie sollte diese Dissoziationskonstante verifiziert werden. Dazu wurden aus den verwendeten Zellen Liposomen hergestellt und diese mit verschiedenen Konzentrationen des Octapeptids 2 analysiert. Bei der durchgeführten STDD-NMR-Titration konnten für das Proton E440-Hγ STD-Effekte ermittelt werden. Die Auswertung der STD-Effekte des Protons E440-Hγ lieferte eine Dissoziationskonstante von 14± 10 mM. Der NMR-spektroskopisch bestimmte KD-Wert liegt in der gleichen Größenordnung und bestätigt die Dissoziationskonstante, die mit Hilfe der Durchflusszytometrie analysiert wurde.

Weiterhin wurde im Rahmen dieser Dissertation eine Konformationsanalyse NMR-spektroskopisch durchgeführt. Um ein geeignetes Mimetikum zu finden, bietet der Ansatz, die Rigidität der Struktur zu fixieren, eine gute Möglichkeit. Da in der Leitstruktur 2 zwei Proline in Folge auftreten, ist dies ein möglicher Angriffspunkt der Fixierung des peptidischen Rückgrats. Um eine Konformationsanalyse durchzuführen, wurden mittels EASYROESY-NMR-Spektren Aufbaukurven aufgestellt, um daraus Abstände interresidualer Protonen zu ermitteln. Weiterhin wurden aus skalaren 3J-Kopplungskonstanten zwischen amidischen und dazugehörigen α-Protonen Torionswinkel bestimmt. Aus diesen Strukturinformationen wurden Abstands-und Winkelbeschränkungen aufgestellt und eine DG-Rechnung unter Verwendung des REDAC-Algorithmus durchgeführt. Die Zielfunktionen der besten 50 ermittelten Strukturen wiesen einen Wert von 0.32 auf. Der rmsd der besten 10 Strukturen von 0.93±0.26 Å begründet eine definierte Struktur des Rückgrats.

Um den Anteil der konservierten Aminosäuren der in dieser Arbeit untersuchten C4-Region spezifizieren zu können, wurde ein Homologiemodell der Sequenz 434-445 durchgeführt. Die Mehrheit der Aminosäuren weist mit über 90% einen hoch konservierten Anteil auf. Lediglich die Positionen 440, 442 und 444 sind sehr variabel.

Es wurden zwei MD-Simulationen durchgeführt. Zum einen sollten die Interaktionen des Octapeptids 2 zum CCR5-Rezeptor in-silico definiert werden. Da die Homologiestudie zeigte, dass die Position 440 variabel ist und ein hoher Anteil der Varianz die Aminosäure Glutamin bestreitet, wurde zum anderen eine MD-Simulation mit dem Homologen 436APPIQGQI443 durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Position 440 keinen Einfluss auf die Affinität zum CCR5-Rezeptor hat. In den MD-Simulationen wiesen besonders das PPI-Motiv und die Aminosäure Q442 hohe Interaktionen zum Rezeptor auf. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass auch das Peptid 2 aus der C4-Region neben der V3-loop an der Interaktion des gp120 zum CCR5-Rezeptor beteiligt ist und somit vermutlich diese Bindung stärkt.


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