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Charakterisierung des humanen Proteins MCM8 und seiner Interaktion mit CDC45

Holtkamp, Linda - Universität Bayreuth (2011)


In der eukaryotischen und archaealen DNA-Replikation spielen MCM-Proteine eine bedeutende Rolle. Ein heterohexamerer Komplex der Proteine MCM2-7 stellt in eukaryotischen Zellen die replikative Helikase dar, welche den DNA-Doppelstrang entwindet und so für die Replikation durch die DNA-Polymerasen zugänglich macht. In den Archaea übernimmt diese Aufgabe ein homohexamerer MCM-Komplex.

Ein weiteres Mitglied der eukaryotischen MCM2-7-Familie ist MCM8. Es gibt Hinweise, dass MCM8 als homohexamere Helikase in der eukaryotischen DNA-Replikation involviert ist, die tatsächliche Funktion des Proteins ist jedoch noch weitgehend unbekannt. Durch Untersuchungen von Tumorgeweben wurde gezeigt, dass humanes MCM8 in den entsprechenden Zellen akkumuliert oder mutiert vorliegt. Dies lässt darauf schließen, dass MCM8 an der Entwicklung von Tumoren beteiligt sein könnte. Für das Verständnis der Krebsentstehung ist daher die Erforschung seiner Funktion von großer Wichtigkeit.

Ziel dieser Arbeit war zunächst, ein geeignetes Expressionssystem zu etablieren, in welchem rekombinantes humanes MCM8 löslich exprimiert und aufgereinigt werden kann. Hierfür wurden Expressionsstudien in Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae sowie Sf9- und High-Five-Insektenzellen durchgeführt.

In S. cerevisiae konnte keine Expression von MCM8 detektiert werden, da das Protein hier möglicherweise toxisch wirkt. In E. coli konnte MCM8 nach einer Co-Expression mit dem Chaperon E. coli Triggerfakor bei einer Expressionstemperatur von 15°C teilweise löslich exprimiert werden. In Insektenzellen konnte MCM8 sowohl in plasmidbasierter transienter Expression als auch in einer Baculovirus-basierten Expression vollständig löslich exprimiert werden.

Das lösliche rekombinante MCM8 wurde mittels Affinitäts-, Heparin- sowie Ionenaustausch- chromatographie aufgereinigt und auf enzymatische Aktivität untersucht. Es war bekannt, dass die anderen MCM-Proteine eine DNA-abhängige ATPase-Aktivität besitzen, und dass diese durch die Mutation eines konservierten Lysinrests im aktiven Zentrum des Proteins ausgeschaltet werden kann. Um eine eventuelle ATPase-Aktivität MCM8 zuordnen zu können, wurde die Aktivität des Wildtyp-Proteins sowie die Aktivität der mutmaßlichen ATPase-Motiv-defekten Mutante MCM8 K460E überprüft. Weder für das in E. coli noch für das in Insektenzellen exprimierten rekombinanten Protein konnte eine ATPase-Aktivität nachgewiesen werden. Auch durch Zugabe von DNA konnte diese Aktivität nicht stimuliert werden.

Dies ließ darauf schließen, dass humanes MCM8 alleine in vitro keine enzymatische Aktivität besitzt. Vermutlich benötigt MCM8 wie der MCM2-7-Komplex in vivo Cofaktoren zur Ausübung seiner Funktion. CDC45 und der GINS-Proteinkomplex gelten als essentielle Cofaktoren der Helikase MCM2-7, welche zusammen als CMG-Komplex den DNA-Doppelstrang entwinden. Wenn MCM8 als Helikase in die DNA-Replikation der eukaryotischen Zelle involviert ist, ist eine Interaktion mit CDC45 wahrscheinlich. Daher wurde in dieser Arbeit die Interaktion von MCM8 mit humanem CDC45 nach Co-Expression der rekombinanten Proteine in High Five-Insektenzellen untersucht.

Hinweise auf eine Interaktion von MCM8 und CDC45 ergaben sich zunächst durch eine Co-Aufreinigung der rekombinanten Proteine Strep_MCM8 und His_CDC45 mittels Talon- und anschließender Strep-Tactin-Chromatographie, in welchen beide Proteine in beiden Aufreinigungs-schritten co-eluierten. Einen weiteren Hinweis lieferte die Co-elution der Konstrukte MCM8_H10 und CDC45 in einer Gelfiltration. Durch Immunopräzipitation von MCM8_H10 und CDC45 aus High-Five-Zellextrakten, wo beide Proteine mit dem jeweiligen Interaktionspartner co-präzipitierten, konnte gezeigt werden, dass MCM8 und CDC45 in vitro interagieren. Eine in vivo-Interaktion der beiden Proteine wurde in HeLa-Zellen untersucht. Hier ergab sich ein Hinweis auf die Interaktion durch Immunopräzipitationen von CDC45 mit einem MCM8-Antikörper aus Zellextrakten logarithmisch wachsender HeLa-Zellen. Die Untersuchung fraktionierter Zellextrakte synchronisierter HeLa-Zellen lieferte Informationen über den Zeitpunkt und den Ort der Interaktion von MCM8 und CDC45 im Zellzyklus.

Es ist bekannt, dass die Proteine MCM2-7 vor allem zu Beginn der Synthese-Phase chromatingebunden vorliegen. Hier konnte gezeigt werden, dass MCM8 und CDC45 gegen Ende der Synthese-Phase und am Übergang der G2- zur Mitose-Phase verstärkt chromatingebunden vorliegen. Dies lässt darauf schließen, dass das humane MCM8 eher in die Elongation als in die Initiation der eukaryotischen DNA-Replikation involviert ist. Es ist ebenfalls denkbar, dass MCM8 eine bisher noch nicht untersuchte regulatorische Funktion besitzt. Die tatsächliche Rolle von MCM8 im eukaryotischen Zellzyklus bleibt weiterhin unklar, bedarf jedoch gerade im Hinblick auf seinen potenziellen Wert als Tumor-Marker weiterer Aufklärung.


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