Quantifizierung der Konzentration von Kupfer(II)-ionen in lebenden Zellen durch Fluoreszenzlebensdauermikroskopie des Grün Fluoreszierenden Proteins
Hötzer, Benjamin - Universität des Saarlandes (2010)
Die Aufklärung intrazellulärer Vorgänge ist wichtig für das Verständnis der dort ablaufenden Prozesse. Lebensdauermikroskopie an Zellen, die Fluoreszenzproteine enthalten, ist eine geeignete Methode, um einen Einblick in lebende Zellen zu erhalten.
Ein Ziel ist dabei die Verfolgung von für die Zelle wichtigen Substanzen und die zeitliche und räumliche Entwicklung ihrer Konzentration. In der vorliegenden Arbeit wird die Bestimmung der Cu2+ Konzentration in verschiedenen Zellen durch eine Änderung der Fluoreszenzlebensdauer (τ) von in die Zellen eingebrachtem Grün Fluoreszierendem Protein (GFP) dargestellt.
Ursache hierfür ist die Bildung eines Komplexes zwischen Cu2+ und GFP. Die verantwortliche Bindungsstelle ist das His6-Tag. Außerdem wird der Mechanismus, der für die Abnahme der Lebensdauer verantwortlich ist, als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) identifiziert. Der Förster-Radius wird zu R0 = 2,1 nm ± 0,1 nm bestimmt. Aufgrund der spektralen Voraussetzungen führt nur die Präsenz von Cu2+ zu einer Änderung der Lebensdauer τ, so dass ein selektiver Sensor entwickelt werden kann.
Zur Quantifizierung von Cu2+ wird ein mathematisches Modell hergeleitet, das die Bestimmung der Konzentration aus der experimentell ermittelten Lebensdauer erlaubt. Die Quantifizierung von Cu2+ kann durch nicht intakte GFP-Moleküle verfälscht werden.
Ein Modell zur exemplarischen Bestimmung der Bildungsseffizienz von GFP wird vorgestellt. Die Bildungsseffizienz wird dabei über die Lebensdaueränderung eines an das GFP gelabelten Farbstoffes bestimmt.