Entwicklung von MS-Bindungsassays für den Serotonin-Transporter
Hess, Marielle - Ludwig-Maximilians-Universität München (2011)
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, Bindungsstudien, die auf einem nicht- markierten Liganden basieren, für den Serotonin-Transporter zu entwickeln, welcher wegen seines Potentials in der Therapie depressiver Erkrankungen gegenwärtig Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen ist.
Bisher in der Literatur beschriebene Techniken, die Target-Ligand-Interaktionen am SERT untersuchen, beruhen meist auf Radioliganden, wie den tritiierten Substanzen [3H]Imipramin, [3H]Citalopram und [3H]Paroxetin oder dem iodmarkierten Kokain-Analogon [125I]RTI-55. Neben klassischen Radioligandbindungsstudien, in welchen der gebildete Target-Ligand-Komplex durch Filtration von freiem Liganden separiert wird, wird für SERT in der Literatur auch ein "homogener" Scintillation Proximity Assay (SPA) zur Untersuchung der Affinität von Testsubstanzen zum Transporter beschrieben. Wegen der beim Einsatz von radioaktiv-markierten Verbindungen gegebenen Nachteile, schien es äußerst lohnenswert, für den Serotonin-Transporter Bindungsstudien mit einem nicht-markierten Liganden zu entwickeln, welche als Label-freie Screeningtechnik bei der Suche nach neuen, potenten Inhibitoren eingesetzt werden könnten.
Für die Realisierung dieses Ziels sollte das im Arbeitskreis entwickelte Prinzip der MS-Bindungsstudien zur Anwendung kommen. Die von Zepperitz et al. für den GABA-Transporter mGAT1 entwickelten MS-Bindungsassays, die als Vorbild für meine Arbeit dienen sollten, werden in Analogie zu klassischen Radioligandbindungsstudien durchgeführt. Nach der Separation des Target-Marker- Komplexes durch Filtration wird der Komplex im Unterschied zu Radioligandassays jedoch dissoziiert, wodurch gebundener Marker freigesetzt und anschließend massenspektrometrisch quantifiziert werden kann.
Für die anvisierten Untersuchungen am SERT sollte kloniertes Targetmaterial verwendet werden, da dieses im Vergleich zu nativem Material den Vorteil höherer Expressionsraten bietet und auch die Zahl störender Proteine geringer sein sollte. Deshalb sollte in meiner Arbeit zunächst eine stabil den humanen Serotonin- Transporter (hSERT) exprimierende HEK-293 Zelllinie als heterologes Expressionssystem etabliert werden.
Für den zu entwickelnden Assay galt es zudem, einen nicht-markierten, sogenannten nativen Marker auszuwählen, wobei der gesamte Pool affiner Liganden des Serotonin-Transporters zur Verfügung stand. Um diesen nativen Marker, der möglichst selektiv und mit hoher Affinität an das Target binden sollte, in den bevorstehenden Experimenten massenspektrometrisch quantifizieren zu können, sollte eine LC-MS/MS Analytik entwickelt werden. Aufgrund der typischerweise in Bindungsstudien zu quantifizierenden subnanomolaren Konzentrationen, sollte mit dieser der Marker bis in den niedrigen picomolaren Konzentrationsbereich zu bestimmen sein. Bei MS-Bindungsstudien dient die de r massenspektrometrischen Quantifizierung vorgeschaltete Chromatographie in der Regel nur der Abtrennung unerwünschter Matrixbestandteile, welche die massenspektrometrische Detektionsleistung sonst negativ beeinflussen könnten und nicht der Trennung von Analyten. Es schien daher möglich, eine effiziente und sehr schnelle Chromatographie zu entwickeln, die in MS-Bindungsstudien am SERT einen hohen Probendurchsatz erlaubt.
Um zu zeigen, dass die entwickelte LC-MS/MS Analytik zur Markerquantifizierung in Bindungsstudien geeignet ist, war beabsichtigt, diese nach den von der United States Food and Drug Administration (U.S. FDA) herausgegebenen Richtlinien zur Validierung bioanalytischer Methoden hinsichtlich Linearität, Richtigkeit und Präzision zu überprüfen. In Sättigungs-, Kompetitions- und kinetischen Exper imenten sollte schließlich die Bindung des Markers und weiterer Inhibitoren an hSE RT mittels des neuentwickelten MS-Bindungsassays untersucht werden. Die erzielten Ergebnisse sollten dann mit Resultaten aus bereits publizierten Radioligandbindungsstudien am Serotonin-Transporter verglichen werden.