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Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zu AmtR, dem Stickstoffregulator in Corynebacterium glutamicum

Hasselt, Kristin - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (2010)


AmtR spielt eine zentrale Rolle im Stickstoffmetabolismus von Corynebacterium glutamicum, einem Actinomyceten von herausragender industrieller Bedeutung. Im Zusammenspiel mit den Signaltransduktionsproteinen GlnD und GlnK stellt AmtR als Masterregulator der Aufnahme und Assimilation von Stickstoff eine wesentliche Funktion in der Herstellung biotechnologisch relevanter Aminosäuren dar. Das AmtR-Regulon und der Regulations-mechanismus wurden bisher eingehend untersucht. In dieser Arbeit wurde der Regulator AmtR, ein Mitglied der TetR-Familie, bezüglich seiner Interaktion mit der DNA und dem PII-Typ Protein GlnK detaillierter analysiert.

Um für Interaktionen relevante Aminosäuren in AmtR zu identifizieren, wurden Aminosäurereste im putativen DNA- und GlnK-Interaktionsbereich modifiziert. Die so variierten AmtR-Proteine wurden gereinigt und in Bindestudien auf ihre Interaktionsfähigkeit mit der DNA bzw. dem GlnK-Protein untersucht. Auf diese Weise konnten, in Kombination mit bioinformatischen Analysen, Aminosäuren von entscheidender Stellung innerhalb der AmtR-DNA-Interaktionsfläche determiniert werden. Hinsichtlich der Interaktion von AmtR und GlnK ergab sich die Problematik, dass die Expression von GlnK im Ursprungsstamm C. glutamicum stattfinden musste, da GlnK lediglich in adenylylierter Form mit AmtR interagiert. Trotzdem wurden in Gelretardationsexperimenten wichtige Aminosäurereste der AmtR-GlnK-Interaktion identifiziert. Ein Protokoll zur Reinigung von GlnK-AMP in großem Maßstab konnte in dieser Arbeit nicht etabliert werden.

Auf Ebene der DNA-Bindestelle innerhalb der AmtR-DNA-Interaktion wurde aufgezeigt, dass weniger die Sequenz als viel mehr die Länge des Zwischenstücks der Palindrome entscheidend für die Bindung von AmtR ist. Die Sequenz der DNA-Bindestelle ist für die Stärke der AmtR-Bindung und damit für die Stringenz der Repression des Gens durch AmtR ausschlaggebend. Im Verlauf dieser Untersuchungen wurde die AmtR-Autoregulation wiederhergestellt mit dem Ergebnis, dass eine AmtR-Autoregulation die Stickstoffmangelantwort verlangsamt. Zusätzlich zur biochemischen Betrachtung des AmtR-Proteins fanden in dieser Arbeit verschiedene Ansätze zur Lösung der dreidimensionalen Struktur über Kristallisation statt. In Kooperation mit der AG Muller gelang es, die Struktur des ungebunden AmtR-Proteins und eines AmtR-DNA-Komplexes zu lösen.


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