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Die Entwicklung sequenzbasierter Schnelldiagnostikverfahren zur Diagnostik von hochpathogenen Erregern

Hartwigsen, Imke - Charité Berlin (2015)


Einige hämorrhagische Fieberviren, wie beispielsweise das Lassa Virus, CCHFV oder das Ebola und Marburg Virus sind hochkontagiös und gehen mit einer hohen Letalitätsrate einher, weshalb sie von besonderer Bedeutung für das klinische Management und den Bevölkerungsschutz sind. In Deutschland haben diese, vornehmlich in den Tropen und Subtropen verbreiteten, Infektionen vor allem aufgrund des zunehmenden Tourismus an Bedeutung gewonnen, durch den es in den letzten Jahren vereinzelt zum Import nach Deutschland kam. Durch ihre relativ unspezifische Anfangssymptomatik ist eine Abgrenzung zu anderen Infektionskrankheiten, wie beispielsweise Malaria oder einer Infektion mit einem nicht isolierbedürftigen hämorrhagischen Fiebervirus anhand des klinischen Bildes häufig schwierig. Um daher im Verdachtsfall angemessen reagieren zu können, werden große Ansprüche an die laborgestützte Diagnostik gestellt. So muss zum einen innerhalb kürzester Zeit eine große Anzahl wichtiger Differentialdiagnosen abgeklärt werden. Zum anderen muss eine zuverlässige virologische Diagnostik unter Hochsicherheitsbedingungen erfolgen, auf deren Basis eine begründete Verdachtsdiagose gestellt bzw. eine Infektion ausgeschlossen werden kann.

Dem entsprechend wurde im Rahmen dieser Arbeit ein Screeningverfahren für hämorrhagische Fieberviren entwickelt, welches die konventionelle Polymerase-Ketten-Reaktion mit der Pyrosequenzierung kombiniert, um die Nukleinsäuren der einzelnen Erreger schnell, sensitiv und spezifisch zu detektieren und diese in der anschließenden Sequenzierung zu typisieren. Da es sich um ein nukleinsäurebasiertes Nachweisverfahren handelt, eignet es sich vor allem in der frühen Phase einer Infektion als Diagnostikmethode. Es ist universell auf eine Vielzahl differentialdiagnostisch wichtiger Erreger sowohl viraler als auch bakterieller und parasitärer Genese anwendbar, die durch die Vereinheitlichung der Temperaturprofile sowie der Kombination einzelner PCR- bzw. PSQ-Assays parallel getestet werden können. Über die Etablierung interner Kontrollen sowie die Konstruktion spezieller Kontrollplasmide wurde bekannten Problemen in der PCR-Diagnostik begegnet und die Zuverlässigkeit des entwickelten Verfahrens weiter erhöht.

Insgesamt bietet somit das entwickelte Screeningverfahren den Ansatz einer sensitiven, spezifischen und auch zuverlässigen labordiagnostischen Abklärung verschiedener hämorrhagischer Fieberviren sowie wichtiger Differentialdiagnosen mit nur einem Verfahren, wodurch vor allem Zeit, Kosten, Reagenzien und auch Probenmaterial gespart werden können.


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