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Rekonstruktion humaner Pigmentierungsmerkmale mittels SNP-Analyse : Entwicklung eines molekulargenetischen Analyseverfahrens sowie dessen Anwendung an degradierter DNA

Harder, Melanie - Christian-Albrechts-Universität Kiel (2012)


In der vorliegenden Arbeit wurde ein molekulargenetisches Analyseverfahren zur Rekonstruktion der humanen Augen-, Haar- und Hautfarbe etabliert. Dieses basiert auf der Analyse von Einzelnukleotidpolymorphismen, auch unter dem Begriff single nucleotid polymorphisms (= SNPs) bekannt, die auf unterschiedliche Art und Weise die Synthese des Pigmentes Melanin regulieren und somit die individuelle Pigmentierung jedes Einzelnen prägen. Dem neu entwickelten Verfahren zur Rekonstruktion des äußeren Erscheinungsbildes liegt eine komplexe statistische Auswertung an insgesamt 400 norddeutschen unverwandten Probanden zugrunde.

Es zeigte sich hierbei, dass sechs (rs12913832 (HERC2-Gen), rs12896399 (SLC24A4-Gen), rs12203592 (IRF4-Gen), rs1805007 und rs1805008 (MC1R-Gen), rs4778138 (OCA2-Gen)) der insgesamt 18 untersuchten SNPs Assoziationen hinsichtlich der Augen-, Haar- und Hautfarbe aufweisen und bei einer Analyse dieser Vorhersagewahrscheinlichkeiten von bis zu 99 % erreicht werden können. Bezüglich der Augenfarbe kann eine Wahrscheinlichkeit von bis zu 95 %, bei der Haarfarbe von bis zu 85 %, beim Hauttyp von bis zu 72 % und beim Rotstich im Haar von bis zu 99 % erzielt werden. Somit kann mit der neu entwickelten Analysemethode die individuelle Pigmentierung einer Person mit hohen Wahrscheinlichkeiten zuverlässig rekonstruiert werden kann. Da diese Methode sowohl in der forensischen Genetik als auch im Bereich historischer und archäologischer Fragenstellungen Anwendung finden soll, wurde die Analyse der sechs signifikanten SNPs speziell auf stark degradiertes DNA-Material abgestimmt.

Resultierend daraus ergaben sich insgesamt fünf Singleplex-PCRs mit Sensitivitäten von bis zu 3,3 pg, was der DNA-Menge einer halben diploiden Zelle entspricht. Um zusätzlich die Aussagekraft der neu etablierten Methode zu überprüfen, wurde diese mit bereits publizierten Verfahren zur Augenfarben- und Haarfarbenrekonstruktion verglichen. Hinsichtlich der Augenfarbenrekonstruktion konnte gezeigt werden, dass die Analyse des SNP rs12913832 (HERC2-Gen), der in dieser Arbeit als Einzel-SNP untersucht wird, ebenso exakt die Augenfarbe vorhersagt, wie eine Analyse der insgesamt sechs SNPs aus Walsh et al. 2011. Bezüglich der Haarfarbenrekonstruktion konnte durch die Anwendung des eigenen Verfahrens, bei dem die drei SNPs rs12913832 (HERC2-Gen), rs12896399 (SLC24A4-Gen) und rs12203592 (IRF4-Gen) untersucht werden, ein aussagekräftigeres Ergebnis im Vergleich zur der Methode von Branicki et al. 2011, mit insgesamt 13 SNPs und den Varianten MC1R_r und MC1R_R, erzielt werden. Auch bei der Rekonstruktion des Rostichs im Haar zeigte sich, dass die Methode dieser Arbeit, bei der lediglich die SNPs rs1805007 und rs1805008 des MC1R-Gens untersucht werden, fast identische Werte im Vergleich zum Analyseverfahren von Branicki et al. 2011 liefert, bei dem wesentlich mehr SNPs untersucht wurden.

Zusätzlich zur Methodenetablierung erfolgte ein Exkurs, bei dem zwei Familienquartetts sowie eine Probandin mit Iris-Heterochromie hinsichtlich ihrer Pigmentausprägungen untersucht wurden. Bei der Analyse der Familienquartetts zeigte sich, dass die Rekonstruktion der Augen-, Haar- und Hautfarbe mit dem neu entwickeltem Verfahren größtenteils sehr zuverlässige Ergebnisse liefert. Hierbei fiel lediglich auf, dass sich bei Wahrscheinlichkeiten um die 50 % eine höhere Fehlerquote zu erwarten ist. Da ebenfalls die Anwendbarkeit der Methode bei speziellen Pigmentanomalien demonstriert werden soll, wurde eine Probandin mit Iris-Heterochromie untersucht. Diese Pigmentanomalie stellt sich in Form verschiedener Pigmentausprägungen der Iris dar. Mit Hilfe der Augenfarbenrekonstruktion konnte bei der Probandin, die eine blau-braune und eine braun-gelb-grüne Augenfarbe aufweist, eine genetische Determinierung für die blaue Augenfarbe festgestellt werden, so dass in diesem Fall eine Hyperpigmentierung des dunkleren Auges angenommen werden.

Ergänzend zur Methodenentwicklung und -validierung wurde das Analyseverfahren an archäologischem Skelettmaterial angewendet. Hierbei wurden den Fragen nachgegangen, wann die heutige europäische Pigmentierungsdiversität und die blaue Augenfarbe entstanden sind. Da sich das Neolithikum (Jungsteinzeit) durch einen extremen Wandel vom Jäger und Sammler hin zum sesshaften Bauern auszeichnet, was mit Gründungen von Dorfgemeinschaften einhergeht, wird diese Phase als möglicher Ursprung der heutigen Diversität angenommen. Es wurden insgesamt 185 neolithische Individuen aus der Zeit 4 500-2 800 BC und 142 mittelalterliche Individuen aus dem 13./14. Jahrhundert als Vergleichspopulation analysiert. Bei insgesamt sechs neolithischen und 21 mittelalterlichen Individuen konnte dessen Pigmentierung zu Lebzeiten teilweise komplett und teilweise partiell rekonstruiert werden. Bei den neolithischen Individuen konnte ein sehr hoher Homozygotieanteil im Vergleich zu den mittelalterlichen Individuen festgestellt werden, so dass anzunehmen ist, dass zu diesem Zeitpunkt noch keine allzu strake Vermischung der unterschiedlichen Populationen erfolgt ist. Die sehr geringe Haplogruppendiversität bekräftigt ebenso diese Aussage.

Somit kann zusammenfassend gesagt werden, dass der Ursprung der heutigen Pigmentierungsdiversität nicht im Neolithikum lokalisiert ist, sondern zwischen dem Neolithikum und dem Mittelalter entstanden sein muss. Bezüglich der blauen Augenfarbe wurde von der Arbeitsgruppe Eiberg et al. 2008 die Hypothese aufgestellt, dass der Ursprung dieser vor 6 000-10 000 Jahren lokalisiert ist. Bei Betrachtung der ermittelten Augenfarben der neolithischen Individuen, die ein Alter von circa 5 000 Jahren aufweisen, zeigt sich ein relativ hoher Anteil der blauen Augenfarbe von 66 %. Dies weist darauf hin, dass die Mutation des SNP rs12913832 für die Ausprägung der blauen Augenfarbe weit vor dem Neolithikum entstanden ist. Die Hypothese wurde somit nicht widerlegt, dennoch kann angenommen werden, dass deren Entstehung eher vor 10 000 als vor 6 000 Jahren erfolgt ist.

Bei allen Untersuchungen wurde höchster Wert auf Kontaminationsvermeidungen mit moderner DNA gelegt. Durch die zusätzlich Analyse der mitochondrialen Haplogruppen und der individualspezifischen STRs der aDNA-Proben, kann eine Kontamination von Seiten der Labormitarbeiter ausgeschlossen werden, was die Authentizität der aDNA-Ergebnisse verstärkt.


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