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Der Nachweis invasiver Pilzinfektionen mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)

Goldbecker, Christoph - Medizinische Hochschule Hannover (2012)


Antimykotika werden oft schon bei geringem Verdacht auf eine systemische Pilzinfektion oder auch prophylaktisch bei Risikopatienten eingesetzt. Dies ist mit nicht unerheblichen potentiellen Nebenwirkungen verbunden und stellt darüber hinaus einen erheblichen Kostenfaktor dar. Die freizügige Indikationsstellung gründet unter anderem auf der unzureichenden Sensitivität und Spezifität der verfügbaren Diagnoseverfahren sowie dem Zeitverlust bis zur Diagnosesicherung.

In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob eine zuvor entwickelte Anreicherung von Pilzzellen aus dem Blut und eine PCR mit anschließender Hybridisierung zur sicheren und raschen Diagnostik bestimmter Pilzinfektionen - insbesondere mit Candida- und Aspergillus-Spezies - aus dem peripheren Blut sowie aus anderem Probenmaterial geeignet ist.

Dazu wurden 315 Blut- und andere Proben von 136 Patienten evaluiert. Die Proben wurden zunächst von humanem Zellmaterial befreit und anschließend die Pilzzellwände enzymatisch, chemisch und mechanisch zerstört. Die so gewonnene DNA wurde mittels genus- bzw. speziesspezifischen Primern in der PCR amplifiziert und die replizierte Pilz-DNA durch Agarosegel-Elektrophorese und Hybridisierung qualitativ und quantitativ bestimmt.

Die Diagnose einer Candida-Infektion gelang bei 136 Patienten mit einer guten Sensitivität (70 %) und Spezifität (93,8 %); der positive Vorhersagewert betrug 87,5 %. Für Aspergillus wurde eine patientenbezogene (n = 122) Sensitivität von 100 %, bei einer Spezifität von 92,9 % bestimmt; der positive Vorhersagewert betrug hier nur 76,7 %.

Wie schon bei anderen Arbeitsgruppen trat auch im Rahmen dieser Untersuchung das Problem der Kontamination durch ubiquitär verbreitete Aspergillus-DNA auf, hier konkret durch eine Low-Level-Kontamination einer zur DNA-Freisetzung und -Aufreinigung verwendeten Chemikalie. Es gelang durch Zerstörung von DNA-Material mit Hilfe des Restriktionsenzyms Sau3AI in einem Dekontaminationsschritt evtl. laborbedingte DNA-Verunreinigungen zu beseitigen.

Im weiteren Verlauf der Untersuchung konnte das geschilderte PCR-Verfahren durch geringfügige Modifikation mit Austausch einzelner reverser Primer erfolgreich zum Nachweis anderer Pilzspezies eingesetzt werden. Darüber wurde eine universelle PCR mit nachfolgender Sequenzierung zur Identifikation unbekannter Pilzspezies eingesetzt und deren labortechnische Verwendbarkeit im Ringversuch bestätigt.

Die PCR ist grundsätzlich zum sicheren und raschen Nachweis einer Pilzinfektion geeignet. Bei hoher Sensitivität und Spezifität ist das Verfahren aber sehr empfindlich auf eine Kontamination, was die praktische Einsetzbarkeit limitiert. Durch geeignetes Vorgehen kann jedoch eine Dekontamination laborbedingter Verunreinigungen ohne Verminderung der Sensitivität erzielt werden.


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