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Die systematische Durchführung der Multicolor-Durchflusszytometrie zur T-Zell-Phänotypisierung mit kritischer Betrachtung der Anwendungsmöglichkeiten und Grenzen

Freiwald, Tilo - Universität Hamburg (2014)


Die funktionelle Beurteilung von T-Zellen ist ein wichtiges, aber bisher nur unbefriedigend gelöstes diagnostisches Problem im Umgang mit Patienten mit eingeschränkter Immunantwort. Die Entwicklung der Multicolor-Durchflusszytometrie bietet neue Möglichkeiten, T-Zell Antworten zu charakterisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Multicolor-Durchflusszytometrie in der Arbeitsgruppe etabliert und anhand praktischer Versuche deren Anwendungsmöglichkeiten untersucht. Dabei wurde ein systematisches Konzept für die Entwicklung von Färbepanels entwickelt, mit dessen Hilfe zwei Panels (Zytokin-Panel und Memory-Panel erstellt wurden. Schließlich wurden die Anwendungsmöglichkeiten und Grenzen des Ansatzes untersucht.

Um zu gewährleisten, dass auch seltene Events zuverlässig detektiert werden können, mussten die Bedingungen des Assays optimiert werden. Als Stimulus war SEB am besten geeignet. Die Inkubationszeit sollte mindestens 5 Stunden betragen. Als optimale Stimulationsdauer zeigten sich 8.5h mit Zugabe eines Golgi-Blockers nach 2h. Die Dichte der Zellen sollte 6*106/ml nicht überschreiten, um eine optimale Antwort nicht zu schwächen. Es ist wichtig, einen Vitalfarbstoff zu verwenden, insbesondere um seltene Events zu messen. Für die intrazelluläre Anfärbung hat sich der amine reactive dye nearIR ViD als geeignet erwiesen.

Für die Auswahl eines Korrelates der Aktivierung spielen die Kinetik, Sensitivität, Spezifität und Handhabung eine Rolle. Unter den hier etablierten Bedingungen waren CD154 für CD4 T-Zellen und CD137 für CD8 T-Zellen am besten geeignet.

Für das Panel-Design ist eine sorgfältige Zuordnung der Antikörper zu den Farbstoffkanälen des Geräts wichtig. Sie erfolgte nach rationalen Kriterien wie Spillover, Fluorochrom-Intensität und Ausstattung des verwendeten Durchflusszytometers. Daraus ergab sich ein Basispanel zur Bestimmung der Haupt-Zellpopulationen, das nach den Anforderungen des aktuellen Experimentes mit Aktivierungsmarkern ergänzt werden konnte: CD56 PE-Cy7, CD4 PerCP-Cy5.5, CD3 PacificBlue und nearIR ViD. Die Kanäle für FITC, PE und Alexa647 blieben für Anpassungen frei.

Die Kompensation der Messungen nimmt eine wichtige Stellung in der Multicolor-Durchflusszytometrie ein. Um eine korrekte Kompensation zu gewährleisten, wurde jeder Antikörper nach einem systematischen Ansatz titriert. Um den Einfluss der Autofluoreszenz von Zellen auf die Kompensationseinstellungen auszuschalten, wurde die Kompensation mit an Beads gebundenen Antikörpern durchgeführt. Als Kontrolle zur Bestimmung der Positivität von Aktivierungsmarkern wurde das Prinzip der fluorescence minus one Kontrolle eingesetzt.

Die in der vorliegenden Arbeit entwickelten Panels wurden exemplarisch angewendet, um ihre Möglichkeiten und Grenzen zu untersuchen. Mit dem Zytokin-Panel konnte die Qualität von T-Zell-Antworten bestimmt werden und Einfach- bis Dreifach-Zytokinproduzenten unterschieden werden. Im T-Zell-Pool eines Normalkollektivs ergab sich eine Aufteilung 7% (triple), 24% (double) und 69% (single) unter den CD4 Zellen und 1% (triple), 28% (double) und 71% (single) unter den CD8-Zellen. Das Normalkollektiv kann als Bezugsrahmen für weitere Messungen verwendet werden. Die Qualität der Antwort spielt eine zentrale Rolle bei der Impfstoffentwicklung.

Die zunehmende Menge an verfügbaren Markern macht einen Konsensus in der Definition von T-Zell-Populationen nötig. Mit dem Memory-Panel wurden die Reifungsstadien von T-Zellen betrachtet. Dabei zeigte sich im Normalkollektiv gesunder Blutspender bei CD4-Zellen eine andere Verteilung als bei CD8-Zellen. Es ist zu definieren welche Abweichungen Krankheitswert haben könnten.

In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Gentherapie des Instituts für Biochemie wurde die T-Zell-Antwort auf eine Tumorvakzine charakterisiert. In der Zytokinbestimmung nach 24h Inkubation zeigten sich deutliche Unterschiede hinsichtlich des Effektes, den die Transfektion unterschiedlicher Zytokine in Tumorzellen auf die Stimulation einer allogenen T-Zell-Antwort erzielten.


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