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Methylierungsmarker zur Identifizierung von Körperflüssigkeiten und Geweben aus forensischem Spurenmaterial

Forat, Sophia - Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn (2014)


Biologische Tatortspuren sollen helfen Täter zu identifizieren und einen Tathergang zu rekonstruieren. Letzteres erreicht man sehr häufig durch eine eindeutige Beschreibung des Gewebes oder der Flüssigkeit, aus der die Spur besteht. Das biologische Material an einem Tatort ist fast immer massiven chemischen, physikalischen oder mikrobiologischen Einflüssen ausgesetzt, die zu seiner vollständigen oder partiellen Zersetzung führen. Am besten charakterisieren Proteine Zellen, Gewebe oder Körperflüssigkeiten. Proteine verlieren aber sehr schnell ihre spezifischen Eigenschaften durch diese exogenen Einflüsse. RNA kann ebenso für die Identifizierung von Körperflüssigkeiten eingesetzt werden, wird aber noch schneller zersetzt. Chemisch-physikalische Messungen können zum mindesten für einen Vortest eingesetzt werden. Gegenwärtig ist keine Methode verfügbar, welche die für die Kriminalistik relevanten Körperflüssigkeiten aus forensischem biologischem Spurenmaterial eindeutig identifizieren könnte. Bei den Körperflüssigkeiten handelt es sich in erster Linie um peripheres Blut, Menstrualblut, Vaginalflüssigkeit, Sperma, Speichel und Haut. In unserer Arbeit wird für den Nachweis von Körperflüssigkeiten und Haut mit der wesentlich stabileren DNA als Analysensubstrat gearbeitet. Die DNA ist zum Teil zellspezifisch methyliert.

Im Verlauf von zwei Genom-weiten Studien (Illumina 27K, 470K) sind zahlreiche differenziell methylierte Genorte identifiziert worden, die als Kandidaten für die Identifizierung der genannten Körperflüssigkeiten infrage kamen. Nach Voruntersuchungen auf der Basis von Bisulfitsequenzierung und SNaPshot-Methode wurden die 10 Methylierungsgenorte mit dem höchsten Differenzierungspotential für die Körperflüssigkeitsanalyse weiter bearbeitet. Als die Methode mit dem höchsten Potential für die praktische forensische Spurenanalyse erwies sich die SNuPE-Analyse. Auf dieser technischen Basis wurden, angepasst an die Sequenzstrukturen der jeweiligen Methylierungsgenorte, verschiedene Verfahren entworfen und etabliert. Dabei handelt es sich um die übliche Primer-Extension Reaktion mit einem Primer, Hybridisierungsverfahren, die gleichzeitig zwei analytische CpGs nachweisen und Kombinationen von mehreren Primer-Extension Reaktionen. Für peripheres Blut, Speichel, Sperma und Vaginalflüssigkeit wurden so jeweils zwei Marker entwickelt, für Menstrualblut und Haut jeweils einer. Die Markerpaare sind z.T. so konzipiert, dass der eine Marker spezifisch auch in Mischungen seine Zielflüssigkeit nachweist und der zweite deren Mischung mit verschiedenen Körperflüssigkeiten anzeigt.

Das hauptsächliche Problem bei der Nutzung von Methylierungsmarkern zur Analyse einer bestimmten biologischen Größe ist der Umstand, dass zahlreiche - auch noch unbekannte - Faktoren den Grad der Methylierung eines CpGs beeinflussen können. Vor allem, um das Ausmaß solch unbekannter Faktoren einschätzen zu können, wurde für jede Körperflüssigkeit bzw. jede spezifische Markergruppe jeweils eine Validierungsstudie mit 80 bis 100 Proben durchgeführt. Trennschärfe, Sensitivität, Analysierbarkeit aus Mischungen und die Robustheit des Verfahrens gegenüber typisch forensischen Einflüssen wurden in kleineren Studien untersucht. Das SNuPE-Verfahren wurde zusammen mit der Bisulfitsequenzierung in Bezug auf seine quantitative Verlässlichkeit mit zwei NGS-Methoden verglichen (Roche 454, Illumina MiSeq). Während die Bisulfitsequenzierung vor allem bei niedrigen Methylierungsgraden unbefriedigend ist, erwies sich SNuPE als zuverlässig und mit NGS vergleichbar.

Seit langem ist der Effekt von Tumoren auf das Methylierungsmuster bekannt. Von hoher prinzipieller Bedeutung war daher die Frage, ob die Markerqualität durch Tumoren beeinträchtigt werden kann. In der Arbeit wurden 12 relativ häufige Tumoren auf diesen Aspekt hin überprüft. Für jeden Marker bzw. seine Zielflüssigkeit wurde ein Tumor, von dem aus eine unmittelbare Einwirkung auf den entsprechenden Methylierungsort denkbar erschien, untersucht - z.B. peripheres Blut und Leukämie. Gleichzeitig wurden jeweils auch die übrigen Marker untersucht. Nicht direkt auf den Marker-Locus der Zielflüssigkeit, wohl aber auf einige der anderen Marker-Loci hatte die Tumorsituation Einfluss. Es wurde eine konservative Abschätzung der durch beliebige Tumorsituationen erzeugten Aussageunsicherheit vorgenommen.

Im Prinzip bekannt, aber im Einzelnen schwer einzuschätzen ist der Einfluss von Sequenzvarianten auf den Methylierungsgrad eines einzelnen CpGs oder einer Gruppe davon. In dieser Arbeit konnte nicht für jede einzelne Probe die Frage nach einer solchen Beeinflussung beantwortet werden, aber es wurde ein Konzept entworfen, welches die grundsätzliche Bedeutung eines solchen Phänomens für das hier zur Debatte stehende Projekt klären sollte. 50 Proben von jeder hier untersuchten Körperflüssigkeit wurden gepoolt und per NGS (Illumina Miseq) sequenziert. Es sollte dabei überprüft werden, ob Sequenzvarianten den SNuPE-Test unmittelbar am analytischen CpG beeinflussen, das Hybridisierungsverhalten des SNuPE-Primers stören oder ob solche Sequenzvarianten auf unbekannte Art und Weise den Methylierungsgrad beeinflussen können. Für solche Effekte wurden eindeutige Beispiele gefunden. Einige, nicht in der Bisulfitreaktion umgesetzte Cytosine zeigten erheblichen Einfluss auf den Methylierungsgrad, so dass man spekulieren konnte, dass es sich um Cytosine handelte, die eine Hydroxymethyl - Gruppe enthalten. Diese Cytosine sind in diesem Fall nicht Teil eines CpGs. Solche Derivate scheinen einen Einfluss auf benachbarte Methylierung zu haben. In dieser Arbeit werden damit genetische und wahrscheinlich epigenetische Faktoren, die den Methylierungsgrad beeinflussen, identifiziert.


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