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Entwicklung neuer Strategien zur Analytik von Glycoproteinen

Fellenberg, Meike - Universität Hamburg (2011)


Als häufigste und komplexeste Modifikation von Proteinen haben Glycane Einfluss auf viele zelluläre Prozesse und sind beispielsweise an der Entstehung von Krebs beteiligt. Die systematische Charakterisierung des Glycoms ist aufgrund limitierter Substanzmengen, der vielfältigen Verknüpfungsmöglichkeiten und dem verzweigten Aufbau aufwendig und schwierig. Dabei ist eine effiziente und präzise Analytikstrategie notwendig, um die Funktion der Glycane besser verstehen zu können.

Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit Methoden zur einfachen und schnellen Charakterisierung von Glycanen entwickelt. Zum eine n wurde die Möglichkeit einer automatischen Spektrenerkennung durch Abgleich mit berechneten NMR-Spektren überprüft. Zum anderen wurde das Konzept der dreidimensionalen Kreuzkorrelation (3DCC) entwickelt, welches durch die gemeinsame Interpretation von MS- und NMR-Daten entlang einer zeitlichen Domäne der LC selbst bei unvollständig getrennten Substanzen eine Spektrenextraktion erlaubt.

Für eine automatische Spektrenerkennung wurden im Rahmen dieser Arbeit die tabellarisch gelisteten chemischen Verschiebungen von 523 Einträgen von der Datenbank "sugabase" zur Berechnung von NMR-Spektren verwendet. Dazu wurden Kopplungsmuster und relative Intensitäten einbezogen, um die Spektren zu berechnen und vergleichbar machen. Anhand dieses Datensatzes konnte das experimentelle Spektrum eines komplex-Typ Decasaccharids eindeutig der korrekten Struktur zugeordnet werden. Somit war eine automatisierte Erkennung der Daten möglich, ohne auf die manuelle Interpretation der Spektren angewiesen zu sein. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch NMR-Spektren von Gemischen unter bestimmten Bedingungen eine Zuordnung der einzelnen Komponenten erlauben. Ein relevanter Faktor für eine zuverlässige Zuordnung stellt hier das Signal-zu-Rausch-Verhältnis der Spektren dar.

3DCC konnte als geeignete Methode zur Charakterisierung von Glycanen in komplexen Gemischen vorgestellt werden. Dabei wurden MS- und NMR-Daten über die gemeinsame Zeitdomäne, die auch aus einer unvollständigen chromatographischen Trennung erhältlich ist, mathematisch korreliert und damit zur Extraktion von NMR-Daten der reinen Komponenten genutzt. Nachdem das Prinzip zunächst mathematisch belegt werden konnte, zeigte sich am Beispiel eines simulierten Chromatographielaufes von zwei biantennären komplex-Typ Glycanen die erfolgreiche Spektrendekonvolution. Anhand dieser extrahierten Spektren konnte eine eindeutige Zuordnung der einzelnen Saccharidstrukturen vorgenommen werden, die sich lediglich durch eine Fucoseeinheit unterschieden. Die Ausweitung auf ein komplexes Gemisch vom bovinen Fibrinogen erlaubte anschließend die Charakterisierung der fünf Hauptkomponenten, die im Chromatogramm starke Überlappungen ihrer Peaks zeigten. Diese Komponenten waren biantennäre Strukturen, die sich durch Fucose-, sowie terminale Galactoseeinheiten unterschieden. Für sehr starke Überlappungen wurden verschiedene Optimierungsmethoden überprüft, um eine verbesserte Extraktion zu erreichen. Durch die Gewichtung des Korrelationskoeffizienten mit der 4.Potenz konnte die Unterscheidung von Signalen verschärft werden, sodass beispielsweise bei einer biantennären Komponente des Gemisches die Identifikation der Verknüpfung des ei nzigen Galactoserestes am 3-Armerreicht werden konnte. Außerdem wurde gezeigt, dass durch 3DCC eine Verbesserung des S/N sowie der Auflösung im Spektrum erreichbar ist. Weiterhin wurde diskutiert, dass Signale, die zu mehreren Komponenten gehören und die gleichen chemischen Verschiebungen aufweisen und deshalb als globale Signale bezeichnet werden, problematisch für die Spektrenextraktion sein können. Hierfür wurden neben der Korrelation nach Pearson die Rangkorrelation nach Spearman und Kendall überprüft, die eine Verbesserung der Extraktion von Signalen von Komponenten mit geringe m Anteil am Gemisch ergeben können. Schließlich konnte gezeigt werden, dass bei Extraktion der Hauptkomponente des analysierten Gemisches, sowie bei den dekonvulierten Spektren des simulierten Chromatographielaufes die automatische Spektrenidentifikation durch Abgleich mit den anhand von "sugabase"-Einträgen berechneten Spektren erfolgreich durchgeführt werden konnte.

In kommerziell erhältlichen Proben des Fibrinogens konnten außerdem unbekannte Strukturen mit zusätzlichem alpha,3-verknüpften Galactoseresten nachgewiesen werden, die Teil eines für den Menschen immunogenen Epitops darstellen. Diese Strukturen sind bisher nicht in der Literatur als Teil der Glycane des bovinen Fibrinogens publiziert. Weiterhin konnten erstmalig NMR-Daten von vier Strukturen dokumentiert werden. Bei drei biantennären Glycanen konnte die variierender Verknüpfung der terminalen Galactosereste gezeigt werden, die entweder am 3- oder am 6-Arm oder an beiden 1,3- statt 1,4-Verknüpfungen aufwiesen. Die Struktur einer triantennären Verbindung konnte erst durch Anwendung von 3DCC aufgeklärt werden, wodurch die Verzweigung der 3. Antenne am 3-Arm und die Position des alpha,3-Galactoserestes am 6-Arm identifiziert wurde. Die hier erhaltenen Ergebnisse dienen als Grundlage für eine effiziente, konsequente und automatisierbare Analytikstrategie zur Charakterisierung von Glycanstrukturen, die die Vorteile von MS und NMR-Spektroskopie vereint, um zuverlässige und schnelle Strukturinformationen zu erhalten. Die Methode der 3D-Kreuzkorrelation kann weitere analytische Verfahren wie IR und MS/MS einschließen und für jede Substanzklasse, die chromatographischen Trennproblemen unterworfen ist, angewendet werden.


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