Entwicklung von Rekombinase-Polymerase-Amplifikations-Verfahren zum schnellen Nachweis von hochpathogenen Erregern
Euler, Anna Milena - Georg-August Universität Göttingen (2015)
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Rekombinase-Polymerase-Amplifikations(RPA)-Verfahren zum Nachweis der hochpathogenen Erreger Sudan-Ebola-Virus (SUDV), ZaireEbola-Virus (EBOV), Marburg-Virus (MARV), Rift-Valley-Fieber-Virus (RVFV), Variola-Virus (VARV), Francisella tularensis (Ftu), Yersinia pestis (Ype) und Bacillus anthracis (BA). Zusätzlich sollte eine interne Positivkontrolle auf der Basis des Sigma-Virus (SIGV, MinusStrang-RNA-Virus, Rhabdoviridae) integriert werden.
Für alle Viren mit einem RNA-Genom (SUDV, EBOV, MARV, RVFV, SIGV) wurden Reverse-Transkriptase(RT)-RPA-Nachweisverfahren etabliert. Der Nachweis bakterieller Erreger (Ftu, Ype, BA) und des Variola Virus (VARV), erfolgte auf der Basis des DNAGenoms. Drei bis acht Primerpaare wurden jeweils für die verschiedenen Erreger anhand der Zielsequenzen selektiert und RPA-Sonden entworfen. Zusätzlich wurden molekulare Standards (107-101 Moleküle/µl) der Zielsequenzen hergestellt und die sensitivsten Primer/Sonden-Kombinationen der einzelnen Verfahren ermittelt. Aufgrund der Stammvariabilität von Francisella tularensis wurden hier zusätzlich verschiedene Stämme analysiert. Die Spezifität der RPA-Verfahren wurde durch Kreuztestungen untereinander und mit humangenomischer DNA untersucht. Die Testverfahren wurden auch mit gespikten Blutplasmaproben (RVFV, SIGV, BA und Ype) analysiert.
Für alle Erreger konnten RPA-Nachweise entwickelt werden. Die analytische Sensitivität lag zwischen 101-103 Molekülen/µl. Die Probit Analyse zeigte, wie viele Moleküle theoretisch in 95% der Testläufe nachgewiesen werden können. Dieser Wert lag für fast alle RPA-Ansätze zwischen 16-21 Molekülen, für den BA(CapC)-RPA-Nachweis lag der ermittelte Wert bei 778 Molekülen. Der Ausschluss von Kreuzamplifikationen zeigte die hohe Spezifität der RPA-Verfahren auf. Beim Vergleich von RPA und Echtzeit-PCR waren beim Einsatz von gespiktem Blutplasma mit vollständigen, inaktivierten Erregern (RVFV, SIGV, BA und Ype) keine nennenswerten Unterschiede zwischen den Ergebnissen der beiden Methoden nachweisbar. Die Vorzüge der RPA liegen jedoch in der Geschwindigkeit des Nachweisverfahrens, da ein Ergebnis schon in weniger als 10 Minuten erzielt werden kann. Die hohe Geschwindigkeit des Verfahrens, der einfache Versuchsaufbau und der erfolgreiche Einsatz an gespikten Blutplasmaproben eröffnen die Perspektive für einen zukünftigen breiten molekulargenetischen Point-of-Care-Einsatz dieses Verfahrens.