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Vergleich von SISPA und random-PCR als sequenzunabhängige Amplifikationsmethoden zum schnellen und einfachen Nachweis unbekannter DNA-Viren

Dittberner, Eva - Ludwig-Maximilians-Universität München (2015)


Die Identifizierung unbekannter oder unvermuteter Viren in Probenmaterial stellt eine Herausforderung im Diagnostikalltag dar. Sequenzunabhängige molekulare Methoden können eine Ergänzung zu konventionellen Techniken bieten. Ziele dieser Arbeit waren die vergleichende Prüfung der sequence-independent single primer amplification (SISPA) und random-PCR als Vertreter sequenz-unabhängiger Methoden zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Viren und die Evaluierung ihrer Tauglichkeit als universell einsetzbare, schnelle, einfache und kostengünstige Alternativen für die Routinediagnostik. Als Modell diente das Equine Herpesvirus-1 (EHV-1), das in verschiedenen Probenmaterialien in ab-steigender Konzentration bei ansteigendem Fremd-DNA-Gehalt vorlag. Durch Schritte zur physikalischen und enzymatischen Virusanreicherung, sequenz-unabhängigen Amplifikation in Kombination mit der konventionellen Sanger-Sequenzierung und einem Datenbankabgleich sollte EHV-1 wiedergefunden werden. Trotz variabler Inhibition durch Gewebebestandteile stellte sich die Enzymbehandlung unter Einsatz einer geeigneten DNase als effektive Methode zur Elimination von Fremd-DNA heraus.

Die Protektion viraler Nukleinsäuren durch Viruskapsid bzw. -hülle, die die Voraussetzung für eine erfolgreiche Durch-führung darstellte, konnte in verschiedenen Materialien gezeigt werden. Weiterhin wurde ein gradueller Verlust an viraler DNA im Verlauf beider Methoden festgestellt, der eine hohe Viruslast im Ausgangsmaterial nötig macht. Sowohl die SISPA als auch die random-PCR führten zu einem vergleichbaren Erfolg beim Virusnachweis in Zellkulturüberstand, infizierten Zellen und Lebergewebe, was für ihre Anwendbarkeit in zellarmen wie auch in zellreichen Proben spricht. Der entscheidende Faktor für den Erfolg beider Methoden schien dabei vor allem die Viruslast zu sein. Ein hoher Zellgehalt in der Probe beeinflusste die Methodik hin-gegen offenbar weniger stark. Der nachgewiesene sequenzunabhängige Charakter stellte aufgrund einer damit einhergehenden erhöhten Kontaminationsanfälligkeit einen Schwachpunkt in der Methodik der random-PCR dar. In dieser Arbeit ist es gelungen, SISPA und random-PCR erfolgreich zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Viren in Gewebe anzuwenden. Für die universelle Einsetzbarkeit zur Diagnostik unbekannter bzw. unvermuteter Viren sollten als nächstes geeignete Schritte der reversen Transkription und Zweitstrangsynthese erprobt werden.


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