Protonentransportgetriebene Konformationsänderungen in einzelnen H+-ATPsynthasen aus Chloroplasten sowie Kombination einer optischen Falle mit konfokaler Fluoreszenzspektroskopie
Bienert, Roland - Albert-Ludwigs-Universität Freiburg (2010)
H+-ATPsynthasen spielen bei der Energieversorgung aller Zellen eine zentrale Rolle. Sie koppeln den transmembranen Protonentransport mit der Synthese von ATP aus ADP und Phosphat. Dabei zeigen diese Enzyme einen einzigartigen Mechanismus, bei dem ein Teilkomplex des Enzyms (Rotor) relativ zu den anderen Untereinheiten (Stator) rotiert. Diese Rotation wurde intensiv an bakteriellen Enzymen untersucht. Für eukaryotische H+-ATPsynthasen konnte die Rotation bei der ATP Synthese erstmalig in dieser Arbeit an dem Enzym aus Chloroplasten (CF0F1) nachgewiesen werden. Dafür wurde der Rotor mit einem Donorfluorophor (ATTO532) kovalent an der Position γ-C322 markiert. Auf dem ersten nicht katalytischen Bindungsplatz (Stator) wurde ein mit einem Akzeptorfluorophor markiertes Nukleotid (ATTO655-AMPPNP) nichtkovalent gebunden. Die doppelt markierten Enzyme wurden in Liposomen rekonstituiert und single pair Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (spFRET) Messungen von frei diffundierenden Proteoliposomen in einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Diese Methode erlaubt es aus der zeitaufgelösten Effizienz des Energietransfers vom Donor auf den Akzeptor intramolekulare Abstandsänderungen in einzelnen Enzymen bei der Katalyse zu verfolgen. Unter nicht-katalytischen Bedingungen wurden Photonenbursts erhalten, die eine konstante und sehr hohe Transfereffizienz (H*AMPPNP) zeigen. Dies entspricht einem niedrigen, während der Beobachtungszeit konstantem Fluorophorabstand, der die Konformation inaktiver Enzyme repräsentiert. Bei Messungen bei der ATP Synthese wurden hingegen Bursts detektiert, die stufenförmige Änderungen in der Transfereffizienz zeigen. Die FRET-Zustände konnten in drei Populationen L (low), M (medium) und H (high) eingeteilt werden. Die Sequenz der Transfereffizienzänderungen innerhalb eines Bursts folgte dabei dem repetitiven Muster L - M - H - .... Die aus den mittleren Transfereffizienzen berechneten Fluorophorabstände wurden mit Abständen aus einem Homologiemodell verglichen, bei welchem die gamma-Untereinheit in drei Schritten um je 120° rotiert wurde. Aus der Übereinstimung der Abstände wurde geschlossen, dass die gamma-Untereinheit in CF0F1 während der ATP Synthese in 120°-Schritten rotiert. Neben Bursts mit stufenförmigen Änderungen wurden auch Bursts mit konstanter Transfereffizienz beobachtet. Dabei wurden ebenfalls die drei Populationen L, M und H sowie eine vierte Population (H*ADP) erhalten, welche der H*AMPPNP Population der inaktiven Enzyme sehr ähnelt und somit vermutlich ebenfalls eine Konformation von inaktiven Enzymen anzeigt. Die Populationen L, M, und H entsprechen Konformationen aktiver Enzyme. Die gelegentliche Detektion von Aktivierungs- und Deaktivierungsschritten an einzelnen Enzymen wurde an prokaryotischen Enzymen bislang noch nicht beobachtet, was auf eine regulatorische Besonderheit der H+-ATPsynthasen höherer Organismen hindeutet, die mit größeren Konformationsänderungen einhergeht.
Die wesentliche Limitierung der hier verwendeten Methode ist das Herausdiffundieren der Proteoliposomen aus dem konfokalen Detektionsvolumen. Dies begrenzt die Beobachtungszeit, was sich besonders in der geringen Zahl der beobachteten Deaktivierungsschritte widerspiegelt. Dieses Problem kann auf elegante Weise durch die Verwendung einer optischen Falle gelöst werden, wodurch die Proteoliposomen im Zentrum des konfokalen Detektionsvolumens fixiert werden können. Dazu wurde im zweiten Teil dieser Arbeit eine apparative Neuerung eingeführt, die erstmalig die Möglichkeit eröffnen soll spFRET Messungen an einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einer optischen Falle durch eine "trifokale Anordnung" zu kombinieren. Das konfokale Fluoreszenzmikroskop wurde dazu mit den Komponenten einer optischen Falle und eines Lichtmikroskops erweitert. Fluoreszenzmarkierte Liposomen konnten mit Hilfe der optischen Falle im Zentrum des konfokalen Detektionsvolumens fixiert werden, wodurch die Beobachtungszeit, verglichen mit frei diffundierenden Proteoliposomen, verdoppelt wurde. Die Beobachtungsdauer der fluoreszenzmarkierten Liposomen nach dem Einfangen hängt nur noch von der Photostabilität der verwendeten Fluorophore ab. Eine Erhöhung der Fluorophorlebensdauer von TMR und ATTO532 wurde apparativ durch die Verwendung einer phasenverschobenen Modulation des Anregungs- und Trappinglasers sowie chemisch durch den Einsatz des ROX-Systems als Triplettlöscher erhalten.
Die schnelle Entvölkerung des Triplettzustands durch das ROX-System in sauerstofffreier Lösung konnte für die Fluorophore TMR und ATTO532 mit Hilfe von FCS-Messungen gezeigt werden. Dadurch konnten zusätzliche Erkenntnisse über den Mechanismus des Fluorophorbleichens bei der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie gewonnen werden.