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Präparation spezieller Biokatalysatoren für die chemisch-technische Nutzung zur Bereitstellung von Aromaten und chiralen α-Hydroxyketonen

Bieler, Nora Christiane - Technische Universität Berlin (2011)


Teil 1 Bereitstellung der Biokatalysatoren LAC, LiP und MnP für deren chemisch-technische Nutzung

Die drei Oxidoreduktasen Laccase (LAC), Lignin- und Manganperoxidase (Li- und MnP) aus Weißfäulepilzen sind technisch sehr interessant, da sie unter Anderem Lignin abbauen können. Vor allem deren zeitaufwändige Produktion in den ligninolytischen Organismen limitiert jedoch industrielle Anwendungen. Daher wurden Möglichkeiten zur Bereitstellung dieser Biokatalysatoren überprüft.

So war es Ziel, die LAC aus Cyathus bulleri, die als besonders reaktiv und stabil charakterisiert wurde, heterolog zu exprimieren. Als Expressionssystem wurde die Hefe Pichia pastorisi ausgewählt, da diese leicht im industriellen Maßstab zu kultivieren ist und da die Expression vieler eukaryotischer Proteine in dieser Hefe bereits gelang. Zunächst wurde die vollständige Nukleotidsequenz der LAC aus C. bulleri identifiziert. Die heterologe Expression gelang anschließend mit einer exzellenten maximalen volumetrischen Aktivität von 125 U/mL. Nachfolgend wurde die rekombinante LAC biochemisch charakterisiert.

Weiteres Ziel war es, die bereits gut untersuchte und sehr reaktive LiPH8 aus P. chrysosporium, analog zu vorherigen Forschungsergebnissen, in der Hefe Pichia methanolica zu exprimieren. Als weiteres Hefeexpressionssystem wurde zudem die Hefe Pichia pastoris untersucht. In beiden Hefen konnte keine LiP-Expression detektiert werden. Bei der MnP-Klonierung wurde ebenfalls die bereits umfassend untersuchte MnP aus P. chrysosporium ausgewählt. Da die Expression dieses Enzyms in P. pastoris bisher zu keiner zufriedenstellenden Expressionsrate geführt hat, wurde auf das gut untersuchte Kluyveromyces lactis Expressionssystem zurückgegriffen, welches im Vergleich zu anderen Hefen rekombinante Produkte oft in besserer Qualität und höherer Ausbeute produziert. Im Falle der MnP-Klonierung konnte keine Expression festgestellt werden.

Teil 2 Präparation der BAL für die chemisch-technische Nutzung

PVA/PEG-Hydrogele werden zur Einhüllung vieler Katalysatoren genutzt. Bisher ist die Produktion jedoch ausschließlich manuell möglich, was industrielle Anwendungen verhindert. Hier ist es gelungen eine automatisierte Produktion von im Hinblick auf Größenverteilung, Form und Gelmorphologie genau definierten PVA/PEG-Polymermatrices mit einer hohen Produktivität von bis zu 1500 Kugeln pro min zu realisieren.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Möglichkeiten der Optimierung für die technische Anwendung der Benzaldehydlyase (BAL) aus Pseudomonas fluorescens zur Bereitstellung enantiomeren-reiner α-Hydroxyketone zu untersuchen. Exemplarisch wurde die (R)-2,2'-Furoinsynthese, katalysiert durch in PVA/PEG-Kugeln immobilisierte BAL, in einem kontinuierlich betriebenen Wirbelschichtreaktor untersucht. Es wurde überprüft, ob die Synthese durch einen Lösungsmittelwechsel, vom bisher stets verwendeten apolaren n-Hexan hin zu polareren Lösungsmitteln (MIBK, MTBE, 2-Methyl-THF) mit erhöhter Produktextraktionskraft, optimiert werden kann. Hierbei zeigte sich, dass die Inaktivierung der BAL durch ihre eigenen Substrate inaktivierende Effekte der Lösungsmittel vollständig überlagert.

Des Weiteren war die Entwicklung einer Eintopfsynthese des sterisch sehr anspruchsvollen α-Hydroxyketon (R)-4,4'-Biphenylbenzoin durch Kombination einer Palladium-katalysierten Kreuzkupplung mit einer BAL-katalysierten Carboligation Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Zunächst wurden beide Reaktionen einzeln charakterisiert und optimiert. (R)-4,4'-Biphenylbenzoin konnte letztendlich mit einer Gesamtausbeute von ~60% und einem ee von über 99,99% synthetisiert werden.


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