Selektion und Charakterisierung von P2X4-spezifischen monoklonalen Antikörpern und Nanobodies
Bergmann, Philine - Universität Hamburg (2016)
P2X4 ist ein ATP-gesteuerter Ionenkanal, der u.a. von Zellen des Immunsystems, Gefäßendothel- und Lungenepithelzellen in Lysosomen und anderen intrazellulären Vesikeln exprimiert wird. Nach Fusion dieser Vesikel mit der Zellmembran kann P2X4 auch an die Zelloberfläche gelangen. Die Aktivierung von P2X4 führt zu einem Einstrom von Ca2+-Ionen und einem Ausstrom von K+-Ionen in das bzw. aus dem Cytosol. Der Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert unterschiedliche nachgeschaltete Prozesse. Ziel dieser Arbeit war es, P2X4-spezifische Antikörper und Nanobodies als experimentelle Werkzeuge für die Untersuchung von P2X4 in humanen und murinen Zellen zu entwickeln und zu charakterisieren. Nanobodies (Nbs oder VHHs) sind Einzeldomänen-Antikörper, die sich von Schwereketten-Antikörpern der Lamas ableiten. Ihre hohe Stabilität, Löslichkeit und leichte Reformatierbarkeit ermöglichen vielfältige Anwendungen.
In dieser Arbeit wurden Nanobodies und monoklonale Antikörper (mAk) aus P2X4-immunisierten Lamas (Nbs) oder Ratten (mAk) gewonnen und bezüglich ihrer Fähigkeit P2X4 spezifisch zu binden oder funktionell zu regulieren untersucht. Dabei konnten vier Antikörper und vier Nanobodies identifiziert werden, die humanes P2X4 spezifisch erkennen sowie drei Antikörper und drei Nanobodies, die Maus-P2X4 spezifisch erkennen. Drei Nanobodies zeigten schwache oder mäßige Kreuzreaktivitäten mit P2X4-Orthologen aus der Ratte. Lediglich ein Nanobody zeigte eine schwache Reaktion mit dem zu P2X4 paralogen Purinrezeptor P2X7. Analysen der relativen Dissoziationsgeschwindigkeit deuten auf höhere Bindungsaffinitäten der monoklonalen Antikörper als der bivalenten Nb-Fc-Fusionsproteine, deren Affinitäten wiederum höher erscheinen als die der monovalenten Nbs.
Kreuzblockade-Analysen zeigten, dass die meisten Antikörper und Nanobodies an überlappende Epitope binden. Patch-Clamp-Analysen der ATP-induzierten Spannungsänderungen in P2X4-transfizierten Xenopus-Oozyten zeigten keinen signifikanten Einfluss der Nanobodies auf die Ionenkanalaktivität von P2X4. Zwei Nanobodies und ein monoklonaler Antikörper konnten erfolgreich zur Detektion und zur Translokation von endogenem P2X4 auf die Zelloberfläche von aktivierten, primären murinen Peritoneal-Mastzellen eingesetzt werden. Die in dieser Arbeit generierten Nanobodies und monoklonalen Antikörper sind hilfreiche Werkzeuge, um die Rolle von P2X4 in Gesundheit und Krankheit zukünftig genauer zu studieren.