HPLC-MS/MS Analyse von Immunsuppressiva direkt in Vollblut. Dissertation
Berger, Irayani - Ludwig-Maximilians-Universität München (2010)
Ziel der vorliegenden Dissertationsarbeit war die Entwicklung und Validierung einer vollautomatischen und störungsfreien Analysenplattform für die massenspektrometrische Bestimmung der vorwiegend erythrozytär gebundenen Immunsupressiva Ciclosporin A, Tacrolimus, Sirolimus und Everolimus direkt in antikoaguliertem Vollblut.
Die Arbeit sollte auf das von Milojkovi entwickelte neuartige Verfahren der Hitzeschock-Behandlung von Vollblut und dessen Überführung in Zell-desintegriertes But (Celldisintegrated Blood, CDB) aufbauen. Ausgearbeitet werden sollte ein vollautomatisches on-line SPE-LC-MS/MS Verfahren mit integrierter thermischer Probenprozessierung. In diesem Zusammenhang sollte zunächst die Matrix CDB durch mikroskopische Verfahren näher charakterisiert werden. Bezüglich der Robustheit des Analysenverfahrens sollte insbesondere die Belastbarkeit der thermischen Prozessierungseinheit untersucht und ein Reinigungsverfahren entwickelt werden. Da bei der Transformation von Vollblut in CDB sämtliches Hämoglobin "freigesetzt" wird, sollte eingehend untersucht werden, in wieweit diese zusätzliche Matrixfraktion abgereichert werden kann. Schwerpunktmäßig sollte die extraktive Aufbereitung der neuartigen Matrix CDB optimiert und in die Plattform integriert werden. Dabei sollte eine multidimensionale Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction, SPE) in Anlehnung an Georgi angewendet werden. Ziel war es, eine selektive Abreicherung der hoch- und niedermolekularen CDB Matrix in dem Maße zu erreichen, dass der negative Elektrospray-Ionisationsprozeß im Tandem-Massenspektrometer nicht gestört wird.
Insbesondere galt es interferierende Phospholipide zu entfernen bzw. von den Zielanalyten abzutrennen. In diesem Zusammenhang sollte zusätzlich ein neuartiges Verfahren zur Optimierung von HPLC-Trennungen, die Phasen-optimierte Flüssigkeits-Chromatographie (POPLC), erstmalig angewendet werden. Das vollständige Analysenverfahren sollte abschließend validiert und mit derzeit verwendeten Methoden, wie Proteinpräzipitation der Vollblutmatrix und getrocknete Blutflecken (Dried Blood Spots, DBS) verglichen werden.