Methodenoptimierung für die automatisierte Proteinidentifikation
Bender, Björn Heiko - Justus-Liebig-Universität Gießen (2010)
Die medizinische Forschung braucht für das Verständnis von Pathomechanismen, bei der Entwicklung von Pharmaka, bei der Erforschung der Funktionen in Infektionserregern und bei der Erforschung zellulärer Antworten auf Infektionen die Methoden der Proteinanalytik. In diesem Zusammenhang sind ganze Proteome von Interesse, da die Zusammenhänge in der Zelle für das globale Geschehen entscheidend sind. Um ein Proteom, also eine Vielzahl an Proteinen möglichst effizient analysieren zu können ist die Automatisierung und Optimierung des Analyseprozesses von entscheidender Bedeutung. In dieser Arbeit wurden einzelne Schritte der MALDI-Analyse des proteolytischen Verdaus variiert und optimiert.
Veränderungen der Proteinidentifikationsrate durch Entfärben von silbergefärbten Gelstücken wurden untersucht. Reaktionszeit und Temperatur des enzymatischen Verdaus wurden variiert. Veränderungen der Proteinidentifikation durch verschiedene Zusätze wie Calcium, Octylglycosid oder Acetonitril im Verdaupuffer wurden beobachtet. Für den Extraktionsschritt wurden Untersuchungen zum Vergleich von Ultraschallextraktion zu Schüttlerextraktion durchgeführt, um ein optimales Auslösen der Peptide zu ermöglichen. Das Volumen der Extraktionslösung wurde variiert. Der Effekt von Acetonitril auf die Extraktion wurde untersucht. Unterschiedliche Matrixpräparationen wurden an C.elegans-Proteinen getestet. Untersuchungen zur automatischen MALDI-Messung wurden an den verschiedenen Matrices durchgeführt. Zur Auswertung wurden verschiedene Suchmaschinen und Datenbanken verwendet.
Es zeigte sich, dass automatisierte Methoden in der Proteinanalytik hervorragend einsetzbar sind. Die Anzahl der identifizierten Proteine mit einer automatisierten Methode war vergleichbar mit der eines manuellen Protokolls. In dieser Arbeit zeigte sich, dass verschiedene Zusätze zu den Verdaupuffern tendenziell eher wenig Vorteile bringen. Ein möglichst kurzer Verdauprozess mit möglichst wenigen Zwischenschritten ist von Vorteil. Für Datenbanksuchen und die Verwaltung der Proteinidentifikationen sind gute Softwarelösungen entscheidend.