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Konfokale Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie

Baumgart, Eugen - Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn (2014)


Mit dem Aufkommen der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie hat sich eine Möglichkeit der dreidimensionalen Abbildung biologischer Proben mit einem bis dahin noch nie dagewesenem Signal-zu-Hintergrundverhältnis eröffnet. Durch punktweises Beleuchten und Verwendung einer sogenannten konfokalen Blende in einer zum Objektivfokus konjugierten Ebene kann eine sehr scharfe Trennung zwischen Fluoreszenzlicht, das aus der beobachteten Objektebene herrührt, und unspezifischem Hintergrundlicht erzielt werden. Nachteilig jedoch ist zum einen eine lange Aufnahmedauer, da die Probe Punkt für Punkt gerastert werden muss, und zum anderen eine hohe Belastung durch das Anregungslicht, was insbesondere beim Aufnehmen von dreidimensionalen Datensätzen zu starkem Bleichen der Fluorszenzmoleküle in der Probe und zu phototoxischen Effekten führt.

Einen alternativen Ansatz bietet seit einigen Jahren die Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie. Hier sind Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang getrennt und orthogonal zueinander angeordnet, mit dem Resultat, dass nur die untersuchte Fokusebene beleuchtet wird und so die Gesamtbeleuchtungsintensität bei der Bildaufnahme deutlich reduziert ist. Die Detektor-Blende ist hier obsolet, da die axiale Selektivität aus der eingegrenzten Beleuchtungsintensitätsverteilung resultiert. Nichtsdestotrotz könnte ein konfokales Detektionsschema auch bei der selektiven Lichtscheiben-Fluoreszenzmikroskopie von Vorteil sein, da dann Streulicht, das zu einer Verminderung des Bildkontrastes führt, unterdrückt würde. Im Rahmen dieser Arbeit soll eine solche Kombination realisiert und eine mögliche Verbesserung der Bilddaten untersucht werden. Hierzu wurde ein Lichtscheibenmikroskop mit gerastertem Beleuchtungsstrahl entwickelt. Zum ersten Mal wurde bei einem solchen Mikroskop eine konfokale Zeilendetektion mit Hilfe des sogenannten Rolling Shutters einer CMOS-Kamera (Complementary metal-oxide-semiconductor) verwirklicht. Im Fokus stand die Untersuchung der optischen Eigenschaften einer solchen Kombination von Lichtblatt-Beleuchtung und konfokaler Zeilendetektion. Die theoretische Form der Punktabbildungsfunktion wurde berechnet und mit praktischen Messungen verglichen. Insbesondere wurde der Frage nachgegangen, wie stark hierbei der Gewinn in der Bildqualität ist und welche potentiellen Vorteile beim Studium biologischer Proben hierdurch entstehen. Als Herausforderung hat sich die Konstruktion eines solchen Gerätes herausgestellt, da es höchste Anforderung an mechanische Präzision und zeitliche Synchronisation zwischen Beleuchtung und Detektion stellt.

Zuletzt wurden mit dem entwickelten Mikroskop unterschiedliche biologische Modellorganismen aus aktuellen Forschungsbereichen untersucht. Dies sollte die Vorteile des konfokalen Detektionsschemas in der Anwendung demonstrieren. Im Fokus lag dabei die Untersuchung der Myelinisierung von Axonen entlang des Rückenmarks in Zebrafischen. Myelinscheiden, die sich um die Nervenfasern bilden, befinden sich in einer Tiefe von 50 bis 100 Mikrometern im Organismus und haben einen Durchmesser von etwa einem Mikrometer. Da das Fluoreszenzlicht aus diesen Probenbereichen eine große Strecke durch heterogenes biologisches Gewebe zurücklegen muss, ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass es dabei gestreut wird. Dies führt zu einem unspezifischen Signal im resultierenden Bild und vermindert den Kontrast. Die Untersuchung mit einem Lichtscheibenfluoreszenzmikroskop ohne konfokale Diskriminierung wird in diesem Fall erschwert, da feine Details häufig nicht mehr zu erkennen sind.


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