Analyse der humoralen, neutralisierenden Immunantwort nach natürlichen Infektionen mit Dengueviren
Auerswald, Heidi - Universität Hamburg (2016)
In dieser Arbeit wurden 280 Seren von DENV-Patienten aus Kambodscha, Vietnam, Kolumbien und Burkina Faso auf ihre Serotyp-spezifische Neutralisation untersucht.
Die Ergebnisse der Neutralisationsexperimente basieren auf über 1600 Tests mit DENV1-4 WHO-Referenzviren sowie acht Dengue-Patientenisolaten aus Kambodscha. Die Virusneutralisation im Serum wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion bestimmt, mit dem Denguevirus-Serotyp aus der akuten Phase der Infektion und mit der Serumreaktivität gegenüber rekombinanten ED3-Antigenen (DENV1-4) verglichen. Dadurch ergaben sich folgende Erkenntnisse: Die Neutralisation gegen den infizierenden Serotyp im Patienten war vermindert und die Entwicklung einer Neutralisationsprävalenz gegen diesen Serotyp war auch einen Monat später nicht zu beobachten. Die höchsten Neutralisationstiter wurden gegen Denguevirus-Serotypen gemessen, die nicht Auslöser der Infektionen waren. Im Vergleich der Neutralisationsdaten mit dem Antigentest wurde eine Korrelation zwischen der Serotyp-spezifischen Neutralisation und der Bindung an das entsprechende ED3*-Antigen beobachtet. Der ED3*-Antigentest ist daher geeignet den aufwendigen Neutralisationstest zu ersetzen. Dies hat Vorteile, speziell bei der Untersuchung des Immunstatus in weiten Bevölkerungsteilen endemischer Gebiete.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Vektorsystem zur Herstellung DENV-pseudotypisierter HIV-1-Partikel entwickelt. Dafür wurden Expressionsvektoren für die prM/E-Hüllproteine von DENV1, DENV2, DENV3, DENV4 und einem chimären DENV2-JEV-Konstruktes hergestellt. Die Expression der Proteine wurde in verschiedenen eukaryotischen Zelllinien optimiert. Für die Bildung der Partikel wurden zwei HIV-1-Vektoren verwendet, die sich in ihrem Genotyp (env, nef und vpr) unterschieden. Dabei stellte sich pNL4-3-Luc-AM als der optimale Retrovirusvektor heraus, da er nef+, vpr+ war und sich das Luciferase-Reportergen unter der Kontrolle des SV40-Promotors befand. Für alle fünf DENV-prM/E-Konstrukte wurden infektiöse, pseudotypisierte HIV-1-Partikel hergestellt, deren Infektion von VeroB4-Zellen quantitativ durch Nachweis der Luciferaseaktivität bestimmt wurde. Dieses etablierte System eignet sich für die Untersuchung von prM/E-Varianten in allen Flaviviren und eröffnet neue Möglichkeit den Hüllprotein-abhängigen Infektionsweg zu studieren.