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Optimierung und Etablierung von Testmethoden und funktionelle Untersuchung verschiedener Aquaporine & Aquaglyceroporine

Almasalmeh, Abdulnasser - Christian-Albrechts-Universität Kiel (2013)


Die vorliegende Arbeit behandelte drei Themen: 1) Klärung der umstrittenen Wasserleitfähigkeit von PfAQP, 2) Ammoniakleitfähigkeit von Aquaglyceroporinen am Beispiel von hAQP8 und PfAQP und 3) H2O2-Permeabilität von Aquaporinen und Aquaglyceroporinen. Durch den Einsatz verschiedener Polyole (Saccharose, Sorbitol, PEG300 und Glycerol) konnte die Wasserleitfähigkeit von PfAQP und EcGlpF geklärt werden. EcGlpF, wie viele Aquaglyceroporine, kann Glycerol aber praktisch kein Wasser transportieren. Die Wasserleitfähigkeit von PfAQP ist von dem eingesetzten Polyol abhängig. In der großen cyclischen Saccharose kann PfAQP sowohl Wasser als auch Glycerol gut leiten. Dagegen hemmt Sorbitol den Wassertransport (IC50 = 0,81 M) und erniedrigt die Glycerolpermeabilität um 80 %. Der Hemmeffekt von Sorbitol beruht nicht auf das Eindringen und Verschließen des Kanals sondern auf die Interaktion mit dem Einmündungsbereich. Glycerol wird durch PfAQP besser transportiert als Harnstoff, auch wenn beide Solute in unterschiedlichen Verhältnissen gemischt sind. Somit trifft die Molenbruch-Anomalie für die Aquaporine unter den herrschenden Testbedingungen nicht zu. Es konnte experimentell ein Protokoll zur Beladung von Hefezellen mit dem pH-sensitiven Fluoresceindiacetat (FDA) etabliert werden, mit dessen Hilfe die Ammoniakleitfähigkeit von Aquaporinen und Aquaglyceroporinen gemessen werden kann. Damit wurde die Ammoniakpermeabilität von hAQP8 und PfAQP gemessen. Beide Aquaporine erhöhten die Ammoniakpermeabilität um das drei- bzw. zweifache gegenüber den Kontrollzellen. Im letzten Teil wurde die H2O2-Leitfähigkeit beider AQP-Subfamilien gegenübergestellt. Die schnell wasserleitenden Isoformen (hAQP1, rAQP1 und hAQP8) sind in der Lage H2O2 schneller zu transportieren als die glycerolleitenden hAP9 und PfAQP. Die Mutante rAQP1 H180A besitzt eine 4mal größere ar/R-Region als der Wildtyp. Um den gleichen Faktor erhöhte sich die H2O2-Leitfähigkeit dieser Mutante. Im Gegensatz dazu verringerte sich die H2O2-Leitfähigkeit von Mutanten, in denen die ar/R-Region verkleinert wurde wie z. B. hAQP8 I200H und rAQP1 H180F.


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